본 발명은(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계; (b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계; (c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계; (d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및 (e) 고정된 증폭 생성물을 검출하거나 정량적으로 측정하는 단계를 포함하여 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 청
본 발명은(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계; (b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계; (c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계; (d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및 (e) 고정된 증폭 생성물을 검출하거나 정량적으로 측정하는 단계를 포함하여 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 청구된 공정을 수행하기 위한 시약 킷에 관한 것이다.
대표청구항▼
(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계; (b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계; (c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계; (d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및 (e) 고정화된 생성물을 정량적으로 및/또는 정성적으로 검출하는 단계를 포함하여, 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법. 제 1항에 있어서, 증폭 생성물이
(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계; (b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계; (c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계; (d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및 (e) 고정화된 생성물을 정량적으로 및/또는 정성적으로 검출하는 단계를 포함하여, 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법. 제 1항에 있어서, 증폭 생성물이 비방사성 표지화 그룹을 통해 검출됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비방사성 표지화 그룹이 면역학적 반응성 그룹, 발광 그룹 및 형광 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물이 표지화 그룹의 혼입에 의해 직접 표지화됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물이 표지화 프로브와의 혼성에 의해 간접적으로 표지화됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 고정화가 흡착성 상호작용에 의해 고체상에서 달성됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법. 제 7항에 있어서, 비오틴이 앵커 그룹으로 사용되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 피복된 고체상이 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상이 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭이 효소의 첨가에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법. 제 10항에 있어서, 열안정성 효소가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 핵산 폴리머라아제 또는 핵산 리가아제가 효소로 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 10항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭용으로 두 개의 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 10항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭이 PCR 또는 LCR에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열이 없는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 레트로바이러스 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도되는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 16항에 있어서, HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도되는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열을 함유하는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 13항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열에 상보적이지 않은 영역을 5' 말단에서 함유하는 제 2 프라이머가 증폭 단계에서 사용됨을 특징으로 하는 방법. 제 19항에 있어서, 제 2 프라이머가 4개 이상의 누클레오티드의 길이를 갖는 연장부를 5' 말단에서 가짐을 특징으로 하는 방법. 제 20항에 있어서, 제 2 프라이머가 GC 부화 연장부를 5' 말단에서 가짐을 특징으로 하는 방법. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 연장 생성물의 추가의 템플레이트 의존성 신장화가 연장 단계 (b) 이후에 수행됨을 특징으로 하는 방법. 제 22항에 있어서, 연장 생성물이 효소적으로 신장됨을 특징으로 하는 방법.제 23항에 있어서, 신장화가 말단 트랜스퍼라아제로 수행됨을 특징으로 하는 방법.제 22항 내지 제 24항 중의 어느 한 항에 있어서, 신장화에 의해 생성된 연장 생성물에 부착된 서열 부분과 혼성될 수 있는 제 2 프라이머가 증폭 단계에서 사용됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, 연장 단계 (b)가 비표지된 누클레오시드 트리포스페이트만이 제 1 프라이머에 부착될 수 있는 방식으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 앵커 그룹을 함유하는 프라이머 및/또는 앵커 그룹을 함유하는 누클레오시드 트리포스페이트를 사용함으로써 특히 증폭 단계 (c) 동안에 증폭 생성물내로 도입되는 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 증폭 생성물과 혼성되는 포획 프로브내에 함유된 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 28항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 정량 검출을 가능하게 하는 내부 표준 물질이 증폭 단계에서 첨가됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 29항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응이 "1-포트(pot) 반응"으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.제 1항 내지 제 30항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 고정화 및/또는 검출이 증폭 부산물을 분리시키지 않으면서 텔로머라아제 연장 생성물의 특이적 검출을 가능하게 하는 조건하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법. 제 31항에 있어서, 특이적 검출이 적합한 혼성 조건을 선택함으로써 가능하게 됨을 특징으로 하는 방법.제 31항 또는 제 32항에 있어서, 특이적 검출이 프라이머 서열에 상보적인 비표지된 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체를 첨가함으로써 가능하게 됨을 특징으로 하는 방법.(a) 텔로머라아제 기질로서 적합한 프라이머, (b) 누클레오시드 트리포스페이트, (c) 텔로머라아제 연장 생성물의 증폭용 제제, (d) 표지화 그룹, (e) 고체상 앵커 그룹 및 (f) 고체상을 포함하는 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 시약 킷. 제 34항에 있어서, 표지화 그룹이 비방사성 표지화 그룹임을 특징으로 하는 시약 킷.제 34항 또는 제 35항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 비오틴이고, 고체상이 스트렙타비딘 및/또는 아비딘으로 피복됨을 특징으로 하는 시약 킷.제 34항 내지 제 36항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상이 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 선택됨을 특징으로 하는 시약 킷.제 34항 내지 제 37항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 누클레오시드 트리포스페이트상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.제 34항 내지 제 38항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 프라이머상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 39항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 증폭 생성물과 혼성되는 표지화 프로브상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 40항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 누클레오시드 트리포스페이트상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 41항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 프라이머상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 42항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 증폭 생성물과 혼성되는 포획 프로브상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 40항 또는 제 43항에 있어서, 표지화 또는 포획 프로브가 올리고누클레오티드 및 핵산 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 시약 킷. 제 44항에 있어서, 표지화 또는 포획 프로브가 펩티드성 핵산임을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 45항 중의 어느 한 항에 있어서, 텔로머라아제 연장 생성물의 추가 신장화용 제제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시약 킷. 제 34항 내지 제 46항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출 반응을 정량화하기 위한 내부 표준 물질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 시약 킷. 레트로바이러스의 LTR-2 서열의 5' 영역으로부터의 올리고누클레오티드를 텔로머라아제 기질로서 사용하는 방법. 제 47항에 있어서, 올리고누클레오티드가 HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.3' 말단에서 (a) 서열번호 2에 나타낸 서열, (b) 80% 이상이 서열 (a)와 상동인 서열 또는 (c) (a) 또는 (b)에 따른 서열의 최종 10개 이상의 누클레오티드를 포함하는 10 내지 50개의 누클레오티드의 길이를 갖는 올리고누클레오티드. 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 방법에서 프라이머로서, 4개 이상, 특히 4 내지 10개의 누클레오티드의 길이를 갖는 말단소립 반복 서열에 상보적인 서열 및 연장 서열을 5' 말단에서 함유하는, 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체를 사용하는 방법.
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