초록

본 발명은 키틴에서 N-아세틸-D-글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 특히 갑각류의 껍질의 키틴을 가수분해하기위하여 효소인 키티나아제족의 앙상블을 사용하여 N-아세틸-D-글루코사민을 생성하는 방법에 관한 것이며, 키티나아제 및 키토비아제를 함유하는 키틴 분해효소의 앙상블로 키틴을 효소적으로 가수분해시킴에 의해 N-아세틸-D-글루코사민을 제조하는 것을 특징으로 한다.

대표청구항 ▼

적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제의 생성을 유도하기위하여 선택된 생물체로 갑각류의 외골격에서 얻어진 키틴을 발효시킴에 의해 얻어진 키틴 분해효소의 앙상블로 키틴을 효소적으로 가수분해하고, 키틴 분해효소의 앙상블에서 N-아세틸-D-글루코사민을 분리하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 N-아세틸-D-글루코사민(2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코오스)을 제조하는 방법.제 1 항에 있어서,키틴 분해효소의 앙상블은 원핵생물체 또는 진핵생물체에서 생성되고 분비되는 적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제를 함유하는 것을

적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제의 생성을 유도하기위하여 선택된 생물체로 갑각류의 외골격에서 얻어진 키틴을 발효시킴에 의해 얻어진 키틴 분해효소의 앙상블로 키틴을 효소적으로 가수분해하고, 키틴 분해효소의 앙상블에서 N-아세틸-D-글루코사민을 분리하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 N-아세틸-D-글루코사민(2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코오스)을 제조하는 방법.제 1 항에 있어서,키틴 분해효소의 앙상블은 원핵생물체 또는 진핵생물체에서 생성되고 분비되는 적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서,상기 키티나아제는 엔도- 또는 엑소-β-1,4-글리카노히드로라제(EC 3.2.1.14)이고, 키토비아제는 β-n-아세틸-글루코사미니다제(HC 3.2.1.30)(아세틸아미노 데옥시글루코히드로라제(BC 3.2.1.29)로서 공지됨) 또는 β-N-아세틸-헥소사미니다제(EC 3.2.1.52)인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 갑각류는 크릴, 작은 새우, 게 및 바닷가재로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서,상기 원핵생물체는 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 및 엔트로박터 리퀴파신스(Enterobacter liquefaciens)로 구성된 그룹에서 선택된 세균성 세포라인인 것을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서,상기 진핵생물체는 트리초더마 하르자눔(Trichoderma harzanum) 및 미로테슘 베루카리아(Myrothecium verrucaria)로 구성된 그룹에서 선택된 진균성 세포라인인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 효소 앙상블은 두단계 클로스-플로우에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 7 항에 있어서,상기 방법이 약 5.5 내지 8 사이의 pH 및 약 25℃ 내지 55℃ 사이의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.(가) 키틴-함유 물질을 발효조 또는 배양용기에 넣고;(나) 원핵생물체 또는 진핵생물체의 접종물을 발효조 또는 배양용기에 넣어서 생물체의 확장 및 키티나아제 또는 키토비아제 활성을 갖는 효소의 생성을 유도함에 의해 배양체를 성장시키고;(다) 배양액으로부터 키틴-분해효소 및 키토바이오스-분해효소의 앙상블을 회수하는 것으로 구성되는 키틴분해효소 앙상블의 제조방법.제 9 항에 있어서,상기 앙상블내 키티나아제-분해효소 및 키토비아제-분해효소가 세포외액내 함유된 것을 특징으로 하는 방법.제 9 항에 있어서,상기 효소가 적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제를 함유하는 키틴 분해효소의 앙상블을 함유하는 여과액을 수득하기위하여 막분리조를 통해 배양액을 통과시킴으로서 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.제 9 항에 있어서,상기 효소가 적어도 하나의 키티나아제 및 하나의 키토비아제를 함유하는 키틴 분해효소의 앙상블을 함유하는 여과액을 수득하기위하여 원심분리기를 통해 배양액을 통과시킴으로서 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.제 11 항에 있어서,막 분리조에서의 투석유물이 발효조 또는 배양용기로 재순환되는 것을 특징으로 하는 방법.제 12 항에 있어서,막 분리조에서의 투석유물이 발효조 또는 배양용기로 재순환되는 것을 특징으로 하는 방법.(가) 발효조 또는 배양용기로 키틴-함유 고체 물질, 정제된 탄수화물이 없는 배지 및 키틴상에서 성장될 때 키틴-분해효소 및 키토바이오스-분해효소을 생성하는 생물체를 넣고;(나) 적어도 하나의 키틴-분해효소(키티나아제) 및 하나의 키토바이오스-분해효소(키토비아제)를 함유하는 키틴 분해효소의 앙상블을 생성 및 분비하는 생물체를 유도하는 방법으로 배양을 실시하여 배양체를 생성하고;(다) 배양액의 다른 성분에서 키틴 분해효소의 앙상블을 분리하고;(라) 키틴-함유 고체를 기계적 또는 생리-화학적으로 처리하고;(마) 분리된 (다)단계의 키틴 분해효소의 앙상블과 (라)단계의 키틴-함유 고체를 고체의 키틴 성분이 N-아세틸-D-글루코사민으로 가수분해되는 키틴-가수분해 반응조로 첨가하고;(바) N-아세틸-D-글루코사민을 함유하는 여과물 스트림 및 키틴 분해효소를 함유하는 투석유물로 키틴 분해효소의 앙상블과 N-아세틸-D-글루코사민을 분리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 N-아세틸-글루코사민의 제조방법.제 15 항에 있어서,키티나아제 및 키토비아제를 함유하는 키틴 분해효소가 키틴-가수분해 반응조로 재순환되는 것을 특징으로 하는 방법.제 15 항에 있어서,(마)단계의 키틴-가수분해 반응조가 연속적인 두단계 반응조인 것을 특징으로 하는 방법.제 17 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 반응조의 작업부피의 바닥부는 효소-함유 이동상이 통과하는 키틴-함유 고체의 충전된 베드를 함유하고, 상부는 키토바이오스-분해효소를 함유하는 고체가 없는 수성액인 단일 유니트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 17 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 효소-함유 이동상이 통과하는 키틴-함유 고체의 충전된 베드를 함유하는 제1 반응조와 하나 또는 그 이상의 키토바이오스-분해효소에 의해 활성화되는 고체가 없는 수성액을 함유하는 교반된 탱크인 제2 반응조인 두 개의 연속된 반응조로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.제 18 항에 있어서,상기 효소 앙상블 공급액이 충전된 베드의 바닥부로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.제 17 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 약 5.5 내지 7.5사이의 pH 및 약 30℃ 내지 약 55℃ 사이의 등온으로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.제 15 항에 있어서,상기 키틴-함유 고체가 선처리되어 키틴의 외부 이용가능성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.제 22 항에 있어서,상기 선처리는 보울 밀화 또는 해머-밀화하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 22 항에 있어서,상기 선처리는 키틴-함유 고체의 스팀 분해 또는 스팀 팽창으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 15 항에 있어서,(마)단계의 키틴-가수분해 반응조는 반-유동화된 베드 반응조인 것을 특징으로 하는 방법.제 15 항에 있어서,(다)단계의 키틴 분해효소의 앙상블은 막 여과방법에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.제 15 항에 있어서,상기 키틴 분해효소 및 N-아세틸 D-글루코사민이 한외여과방법에 의해 여과물 스트림으로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.(가) 발효조 또는 배양용기로 키틴-함유 고체 물질, 정제된 탄수화물이 없는 배지 및 키틴상에서 성장할 때 키틴-분해효소 및 키토바이오스-분해효소을 생성하는 생물체를 넣고;(나) 적어도 하나의 키틴-분해효소(키티나아제) 및 하나의 키토바이오스-분해효소(키토비아제)를 함유하는 키틴 분해효소 앙상블을 생성 및 분비하는 생물체를 유도하는 방법으로 배양을 실시하여 배양체를 생성하고;(다) 배양액의 다른 성분에서 키틴 분해효소의 앙상블을 분리하고;(라) 키틴 분해효소의 앙상블 및 키틴-함유 고체를 고체의 키틴 성분이 N-아세틸-D-글루코사민으로 가수분해되는 키틴-가수분해 반응조로 첨가되고;(마) N-아세틸-D-글루코사민을 함유하는 여과물 스트림 및 키틴 분해효소의 앙상블을 함유하는 투석유물 스트림으로 키틴 분해효소의 앙상블과 N-아세틸-D-글루코사민을 분리하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 N-아세틸-글루코사민의 제조방법.제 28 항에 있어서,키티나아제 및 키토비아제로 구성된 키틴 분해효소가 키틴-가수분해 반응조로 재순환되는 것을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서,상기 (마)단계의 키틴-가수분해 반응조가 연속적인 두 단계의 반응조인 것을 특징으로 하는 방법.제 30 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 반응조의 작업부피의 바닥부분은 효소-함유 이동상이 통과하는 키틴-함유 고체의 충전된 베드를 함유하고, 상부는 키토바이오스-분해효소를 함유하는 고체가 없는 수성액인 단일 유니트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 30 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 효소-함유 이동상이 통과하는 키틴-함유 고체의 충전된 베드를 함유하는 제1 반응조와 하나 또는 그 이상의 키토바이오스-분해효소에 의해 활성화되는 고체가 없는 수성액을 함유하는 교반된 탱크인 제2 반응조인 두 개의 연속된 반응조로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.제 31 항에 있어서,상기 효소 앙상블 공급액이 충전된 베드의 바닥부로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.제 30 항에 있어서,상기 두단계 반응조는 약 5.5 내지 7.5 사이의 pH 및 약 30℃ 내지 55℃ 사이의 등온을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서,상기 키틴-함유 고체가 선처리되어 키틴의 외부 이용가능성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.제 35 항에 있어서,상기 선처리는 보울 밀화 또는 해머-밀화되는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.제 35 항에 있어서,상기 선처리는 키틴-함유 고체의 스팀 팽창 또는 스팀 분해로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서,상기 (마)단계의 키틴-가수분해 반응조는 반-유동화된 베드 반응조인 것을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서,상기 (다)단계의 키틴 분해효소의 앙상블은 막여과 방법에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서,상기 키틴 분해효소 및 N-아세틸 D-글루코사민은 한외여과방법에 의해 여과물 스트림으로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.