초록 ▼

▷ Phytase 생산균주의 분리 및 동정
- 토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytase를 생산하는 균주를 분리하였다. 형태학적, 생화 학적, 세포벽 지방산 조성 분석, 16S rRNA gene sequencing과 chromosomal hybridization 분석 결과 Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었고, B.amyloliquefaciens DS11로 명명하였다. B. Amyloliquefaciens DS11로부터 phytase 효소생산 최적배지 조성은 6%

▷ Phytase 생산균주의 분리 및 동정
- 토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytase를 생산하는 균주를 분리하였다. 형태학적, 생화 학적, 세포벽 지방산 조성 분석, 16S rRNA gene sequencing과 chromosomal hybridization 분석 결과 Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었고, B.amyloliquefaciens DS11로 명명하였다. B. Amyloliquefaciens DS11로부터 phytase 효소생산 최적배지 조성은 6% wheat bran, 1% casein hydrolysate, 0.04% (NH4)2SO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.04% K2HPO4, 0.05% KH2PO4, 0.02% CaCl2, pH 7.0 이였으며 37℃에서 24시간 배양했을때 효소 생산이 가장 높았다.
▷ Phytase의 정제 및 특성조사
- Phytase는 acetone침전, Phenyl-Sepharose, Resource S, Superose 12 column chromatography를 통하여 정제도 77배, 수율 10%로 정제되었고, SDS-PAGE에서 분자량 44,000, gel filteration에서 40,000 dalton를 통하여 단일 subunit으로 이루어진 단일 효소임을 확인했다.
Phytase의 최적 pH는 7.0, 최적 온도는 70℃였으며 pH 4.0-8.0, 90℃까지 안정하였으며 Ca²+에 의해 온도 안정성이 증가하였다. Phytase의 아미노산 조성을 분석한 결과 Asp, Glu과 같은 산성 아미노산과 la, Leu, Gly등의 함량이 높았다.
Phytase의 N-말단 아미노산 분석 결과 기존에 보고된 것과 전혀 다른 새로운 효소로 확인되었다.
Phytase는 MnCl2, CdCl2 와 EDTA에 의해 활성이 저해되었으며 5 mM CaCl2에 의해 활성이 회복되어 가역적 저해 현상을 지니고 있었다. Phytase는 inositol polyphosphate인 phytate에만 특이적인 분해능을보였고, sodium phytate에 대한 Km은 0.55 mM이었다.
효소는 2,4,6-trinitrobenzene-1-sulfornic acid, diethyl pyrocarbonate, N-bromosuccinimide에 의해 활성이 저해되어, 활성부위에 Trp, Lys, His이 존재할 것으로 추측하였다.
Phytase는 wheat bran, rice flour, corn meal, soybean meal의 다양 한 곡물에서 분해능을 보여 곡물의 영양학적 가치를 증가시키는데 이용될 수 있으리라 본다.
▷ Phytase의 유전자에 관한 연구
- B. amyloliquefaciens DS11의 chromosomal DNA를 template로 이용하고, 정제된 효소의 N말단과 CNBr 처리한 internal fragment의 N-말단을 각각 oligodeoxyribonucleotide primer로 PCR을 수 행한 결과 600 bp의 DNA fragment를 얻었다.
PCR fragment를 probe로 이용하여 colony hybridization을 수행한 결과 2.2 kb의 phytase gene (phy)이 삽입된 pKP1을 제조하였다.
Subcloning하여 DNA 단편의 염기 배열을 결정한 결과 1152 bp의 phy의 ORF를 확인하였으며 383 개의 아미노산으로 이루어진 분자량 41,808 dalton의 단백질임을 확인하였다.
Phy 유전자는 ATG를 translation start codon으로 사용하고 있었으며 Bacillus 유래의 ribosome binding site 가 존재하였다.
Mature 한 연구 Phytase의 대량생산을 위하여 T7 strong promoter을 가지는 pET22b(+) vector에 precursor 와 mature phytase 형태의 pEPK1와 pEPK2을 제조하였다.
E. Coli BL21(DE3)/ pEPK2에서 유도물질로 IPTG을 이용시는 induction 3시간 후, lactose를 이용시 는 induction 4시간 후에 phytase가 고발현되었으며 이는 원균주에 비해 50배 가량 증가한 것이다. Western blot 분석을 통해 E. coli에서 고발현된 E. coli BL21(DE3)/pEPK2가 생산하는 phytase가 면역학적으로 원균주인 B. amyloliquefaciens DS11 phytase와 동일함을 확인하였다.
Phytase의 B. subtilis에서 대량 생산을 위하여 BJ27 strong promoter을 가지는 pJH27 vector에 2.2 kb의 phytase gene을 포함한 pJPK을 제조하였다. B. subtilis DB104 (pJPK)은 접종 후 11 시간의 배양 상층액에서 원균주에 비해 30배 가량 과잉

목차 Contents

• 제1장. 서론...17
• 제2장. 국내외 기술개발 현황...21
• 제1절. Phytase의 연구개발 현황...21
• 1. 외국의 경우...21
• 2. 국내의 경우...22
• 제2절. Phytase의 세부 기술현장...22
• 1. 외국의 경우...22
• 2. 국내의 경우...23
• 제3장 국내개발수행 내용 및 결괴...25
• 제1절. 연구수행방법(실험방법)...25
• 1. Phytase 생산균주의 선별...25
• 2. Phytase의 분리 및 정제...25
• 3. Phytase 활성측정...26
• 4. 단백질 정량...26
• 5. 분자량 측정...26
• 6. N-말단 아미노산 서열 결정...27
• 7. Phytase의 측정...27
• 8. DNA 조작 및 sequencing...27
• 9. E. coli의 transformation과 electroporation...28
• 10. Bacillus의 protoplast transformation...28
• 11. Internal amino acid sequence 분석...29
• 12. Polymerase chain reaction(PCR)...29
• 13. 고발현 단백질의 확인...29
• 제2절. Phytase 생산 균주의 분리 및 동정...30
• 1. Phytase 생산 균주의 분리 및 동정...30
• 2. Phytase 생산을 위한 균주의 배양...32
• 제3절. Phytase의 정제 및 특성조사...33
• 1. Phytase의 정제...33
• 2. 효소활성에 미치는 pH의 영향과 효소의 pH안정성...34
• 3. 효소활성에 미치는 온도의 영향과 효소의 온도 안정성...35
• 4. 효소의 N-말단 아미노산 서열 확인...36
• 5. 효소의 아미노산 조성 분석...36
• 6. 효소의 기질 특이성...38
• 7. 금속이온과 화학제의 영향...38
• 8. 화학수식제의 영향...40
• 9. 곡물에서 phytase의 가수분해...41
• 제4절. Phytase의 유전자에 관한 연구...41
• 1. Phytase-specific DNA 단편의 증폭...41
• 2. Southern hybridization...43
• 3. Colony hybridization...44
• 4. Phytase 유전자의 제한효소 지도 및 subcloning...44
• 5. Phytase 유전자의 염기배열 분석...44
• 제5절. Phytase의 고발현에 관한 연구...47
• 1. phytase의 E. coli에서 고발현...47
• 가. 발현 plasmid의 제조...47
• 나. T7 promoter을 이용한 phytase의 고발현...47
• 다. 유도 물질이 발현에 미치는 영향...50
• 라. 원균주 유래 phytase와의 면역학적 반응 조사...51
• 2. Phytase의 B. subtilis에서 고발현...52
• 가. 발현 plasmid의 제조...52
• 나. BJ27 promoter를 이용한 phytase의 B. subtilis에서 고발현...53
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...55
• 제1절. 연구개발 목표달성도...55
• 1. 토양시료에서 phytase생산균의 분리 및 동정...55
• 2. Phytase의 정제 및 특성조사...55
• 3. Phytase의 cloning 및 sequencing에 관한 연구...56
• 4 Phytase의 고발현에 관한 연구...56
• 제2절. 대외기여도...56
• 제5장. 연구개발결과의 활용계획...58
• 제6장. 참고문헌...59