보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 Seoul National University |
연구책임자 |
김종국
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참여연구자 |
이명걸
,
심창구
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1989-12 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
서울대학교 Seoul National University |
등록번호 |
TRKO200200012651 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
Drug delivery system.controlled release.drug-macromolecule conjugate.anticancer agent.pharmacokinetics.bioavaility.Drug delivery system.controlled release.drug-macromolecule conjugate.anticancer agent.pharmacokinetics.bioavaility.
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초록
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본 연구에서는 약물수송체 (drug delivery system)을 개발하는데 핵심이 되는 제어방출형 (controlled release)과 특정장기 혹은 조직 표적성 9specific organ or tissue targeting)을 집중적으로 연구하기 위하여 주사제용 장기표적성 제어방출형 약물수송체 및 경구용 제어방출형 약물수송체 및 경구용 제어방출형 약물수송체를 설계하기 위한 기초 연구를 다음과 같이 수행하였다.
제 1 세부과제인 "알부민 미립구를 이용한 간 표적용 서방성 약물수송체의 개발에 관한 연구 : 항암제
본 연구에서는 약물수송체 (drug delivery system)을 개발하는데 핵심이 되는 제어방출형 (controlled release)과 특정장기 혹은 조직 표적성 9specific organ or tissue targeting)을 집중적으로 연구하기 위하여 주사제용 장기표적성 제어방출형 약물수송체 및 경구용 제어방출형 약물수송체 및 경구용 제어방출형 약물수송체를 설계하기 위한 기초 연구를 다음과 같이 수행하였다.
제 1 세부과제인 "알부민 미립구를 이용한 간 표적용 서방성 약물수송체의 개발에 관한 연구 : 항암제 수송체의 개발"에서는 부작용이 심한 항암제인 adriamycin, cytarabine, 5-fluorouracil, methotrexate 및 이들과 인혈청 알부민의 공유결합체를 간에 집중적으로 수송 할 수 있고 간에서 장기간 약효를 발현시킬 수 있는 간 표적용 약물수송체를 개발하기 위하여 상기 약물이 함유된 인혈청 알부민 미립구의 제조방법을 개발하고 최적조건을 확립하였다. 또한 동물실험을 통하여 생체내에서 알부민 미립구의 분포 및 간에 집중적으로 축적되는 특성을 TEM 사진 및 간조직 검사법으로 확인하고 주요 장기에서의 약물수송에 대한 약물동력학적 연구를 행하였다. 간에 uptake된 미립구는 그 부위에서 수주간 지속적으로 항암제를 제어방출하면서 약효를 발현한후 소실되었으며, 이때의 약물방출속도는 미립구의 제조조건에 따라 차이가 있다. 실험후 동물의 각 주요장기에 대한 조직검사 결과 타장기에는 독성이 거의 없음을 확인하였다. (상세한 내용은 별첨 제 1세부과제 요약문 참조).
제 2 세부과제인 "Biopolymer를 이용한 Novel Drug Delivery System의 개발에 관한 연구 : 항암제 수송체의 개발"에서는 Methotrexate(MTX)-인혈청 알부민 (HSA), MTX-토끼혈청 알부민(RSA), 및 MTX-polylysine 그리고 5-fluorouracil(5-FU)-초산(AA), 5-FU-AA-HSA 및 5-FU-AA-polylysine 같은 항암제-생체고분자의 공유결합체의 합성 방법을 확립하고 이들의 안정성에 대하여 반응속도론적으로 연구하였다. 또한 이들 공유결합체를 30분간 정맥투여하거나 근육주사 했을때 pharmacokinetics와 각 조직에 대한 분포 및 일정시간 후 각 장기에 남아 있는 MTX 및 5-FU의 양을 free MTX 및 5-FU를 투여하였을때와 비교하였다.
공유결합체를 정맥투여한 후 parent drug과 비교하였을때 혈장내에서 약물의 normal clearance, 평균체류시간 (mean residence time), 분포용적 (volume of distribution) 및 steady state 값들이 상당히 증가하였다. 공유결합체로 합성하여 투여하였을때 혈장내에 8시간 이상 일정 농도를 유지할 수 있으므로 제어방출성형임을 확인하였다. 신장장애가 심한 MTX의 경우 공유결합체로 투여하였을 때 신장 및 위장관의 약물농도가 현저히 감소되므로 독성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. (상세한 내용은 별첨 제 2 세부과제 요약문 참조).
제 3 세부과제인 "경구투여용 제어방출형 정제의 개발"에 관한 연구에서는 속용정의 core tablet을 제조한 후 표면을 microporous한 polymer membrane으로 coating 함으로써 경구투여 후 위장관내에서 이 pore를 통하여 내용약물이 방출되는 DDS를 설계하고 제조한 다음 in vitro와 in vivo에서 평가하였다. 우선 대상약물로는 acetaminophen을 선정하여 이방법으로 제어방출형 정제를 제조하였다. 이 정제는 acetaminophen의 pharmacokinetics로 부터 바람직한 혈중농도 pattern을 나타내 줄 수 있는 release rate를 갖도록 acetaminophen의 particle size, core tablet의 formulation, membrane coating액의 조성등의 면에서 다각적인 검토를 하였다. 그 결과 in vitor에서 8시간 이상 o-order kinetics의 약물방출 위장판내 pH 변동범위에서는 일정하엿으며 이 membrane은 붕해도 시험에 안정하여 경구투여시 membrane이 파열될 우려가 낮음을 알았다. 사람에게 in vitro 평가를 한 결과 속용정과 함께 병용투여하면 혈중농도가 지속됨을 알 수 있었다. 그러나 acetaminophen의 first-pass effect 때문에 그 지속효과는 최초에 기대한 만큼은 미치지 못하였다.
이 membrane coating 방법의 우수성은 acetaminophen 정제의 in vitro release test에서 확립되었으므로 이번에는 first-pass effect가 작은 theophylline의 제어방출형 정제를 이 방법으로 제조하기로 시도하였다. Release rate의 설계는 시판 theophylline 정제 중 사람에서의 in vivo 혈중농도의 지속성이 가장 좋은 정제의 release rate를 참고로 하여 설정하였다. 이렇게 하여 여러가지 검토끝에 제조한 정제들은 역시 o-order release를 보였으며 그중 한가지 정제만을 골라 사람에게 투여한 후 in vivo saliva 농도를 측정하여 본 결과 외국에서 시판되고 있는 제어방출형 theophylline 정제 이상으로 혈중농도 지속효과가 있었다. 즉 투여후 48시간 후까지도 혈중농도가 유지되었다. 본 연구에서 사용한 연구방법은 외국의 정제와는 다른 방법으로 제조한 것으로 특히 제조방법에 특별한 신규 설비가 필요하지 않아 국내제약산업계에서 단기간내에 적응할 수 있으리라 생각된다. 결론적으로 membrane coating 방법에 의한 제어방출형 경구용 DDS 제조에 관한 확실한 응용가능성을 본 연구를 통하여 확립할 수 있었다.
이상과 같은 약물수송체 개발에 관한 연구결과를 토대로 임상적 측면에서 좀더 구체적인 연구를 진행하면 국내에서 부작용이 적고 특정장기에 선택적으로 약효를 더욱 발현할 수 있는 새로운 형태의 특정장기 표적성 제어방출형 항암제 주사제의 제조가 가능하며 또한 경구용 제제개발 면에서도 1일 1회 경구 투여로 위장판내에서의 부작용을 제거하고 혈중농도를 일정하게 1일간 유지시켜 줄 수 있는 새로운 제품의 개발이 가능하다고 사료된다.
Abstract
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Controlled release and specific organ or tissue targeting is of the major challenges for the developmentof drug delivery system. Current investigations were carried out on the purpose of design of organ targeting controlled release drug delivery system for injection and controlled release oral d
Controlled release and specific organ or tissue targeting is of the major challenges for the developmentof drug delivery system. Current investigations were carried out on the purpose of design of organ targeting controlled release drug delivery system for injection and controlled release oral drug delivery system as follows.
1. Development of liver targeting controlled release drug delivery system using albumin microspheres
Delivery of chemotherapeutic agents such as anticancer agent to target sites such as specific organs and specific cells at proper rate and amount, constitutes one of the major challenges of chemotherapy. The present investigation was carried out on the purpose of the development of specific organ targeting durg delivery system that could achieve to maximize the therapeutic effect and to minimize the systemic toxicities of anticancer agents.
In this investigation, we developed liver targeting durg delivery system that could delivery anticancer agents such as adriamycin, cytarabine, 5-fluorouracil, methotrexate, into liver selectively, and evaluated the possibility of the potential use of it as follows. First, we established the synthesis of durg-macromolecule conjugates and the optimum preparation conditions of hydrophobic albumin microspheres by heat denaturation method and those of hydrophobic and hydrophilic albumin microspheres by chemical cross-linking ethod with glutaraldehyde.
We investigated the shape and size distribution of microspheres, drug incoporation efficiency, hydrophilicity, in vitro release pattern with or without protease, properties of matrix degradation and pharmaceutical characteristics (dispersion property, stability of suspension), and developed the practical techiniques by considering collectively the problems that could be produced at the intraveneous injection.
It was especially developed the new techniques that could increase the drug incoporation efficiency and control the release of durg at the desired rate by using the constant ratio of drug-macromolecule conjugates and free drug in the preparation of albumin microspheres. We could also improve the pharmaceutical defects of the existing albumin microspheres by modifying the surface of hydrophobic microspheres with hydrophilic carboxyl group of glycine.
Whole body scanning with [99mTc]-labeled albumin microspheres showed the localization of radioactivity in organs with reticuloendothelial system, especially in liver. Albumin microspheres were phagocytized and stored in the liver and eliminated at slow rate over the time of 8-10 weeks. The elimination rates of albumin microspheres in the liver are affected by the preparation conditions(heating temperature and time, the amount of cross-linking agent and cross-linking time, albumin concentration, the combination ratio of free drug and drug-albumin conjugate, ect. ) of albumin microspheres.
The shape of albumin microspheres were spherical and the surface was smooth and compact. Hydrophilic albumin microspheres were easily dispersed in aqeous medium without the need of surfactants, and the dispersed system remained stable enough for the injectable suspension. As the amount of drug-albumin conjugates in the preparation of hydrophilic albumin microspheres increased, in vivo release and matrix degradation by protease delayed and the in vivo elimination of drug also delayed. Namely, albumin microspheres with high dose of drug-albumin cinjugates showed the high AUC of drug in several organs in vivo and this means that in vivo release is very correlative with in vitro release. As the amount of drug-albumin conjugates increased, drug incoporation efficiency also greatly increased, for example, free 5-fluorouracil was hardly incoporated in albumin microspheres, but 5-fluorouracil-acetic acid conjugates was greatly incoporated like methotexate.
Liver targeting efficiency depended upon rather volume distribution than number distribution of microsphere size. Albumin micrispheres were distributed into lung rapidly after intravenous injection and the microspheres in the lung were rapidly eliminated and re-distributed into the other organs (liver, spleen, etc). The quantity of drug in spleen was abut 1/20 of that in liver, but the patterns of the quantity of drug-time curve were similar.
The use of adriamycin is limited by the manifestation of severe side effects, especially cardiotoxicity. The adriamycin-entrapped albumin microspheres were little absorbed in the heart after intravenous injection, and no histopathological changes were observed in the liver, spleen and heart, 8 weeks after intravenous injections.
Anticancer agent-entrapped albumin microspheres were prepared by new techniques obtained from this investigation. Cancer chemotherapy used by these albumin microspheres provides less frequent administration, constant and continuous therapeutic drug levels in the liver, and a reduction in undesirabe side effects.
2. Development of novel drug delivery system using drgu0biopolyner conjugates
Methotrexate (MTX)-rabbit serum albumin (RSA), MTX-human serum albumin (HSA) and MTX-polylysine, and 5-fluorouracil (5-FU)-acetic acid (AA), 5-FU-AA-HSA and 5-FU-AA-polylysine conjugates were synthesized by reported method, and their stabilities were investigated. The phamracokinetics and tissue distributions of MTX or 5-FU after 30-min infusion or intramuscular injection of the above conjugates were also compared using MTX and 5-FU, respectively as a control. Rabbit was employed as a model animal.
The release of MTX from MTX-HSA conjugate was increased in the presence of protease or liver homogenate. Similar results were obtained from the release of 5-FU from 5-FU-AA-HSA conjugate. It is of interest to note that MTX was released biexponentially from MTX-HSA conjugate. It indicated that the MTX which is weakly bound to the conjugate could be released faster and then MTX which is tight covalently bound to the conjugate could be released slowly in later period (after 6-hours of incubation)! However, 5-FU was released monoexponentially from 5-FU-AA-HSA conjugates.
The plasma concentrations of MTX rose slowly during infusion and declined sloyly post-infusion after intravenous infusion of MTX-RSA conjugate. The values of nonrenal clearance, mean residence time and volume of distrivuion at steady state were significantly increased after administration of the conjugate. IT indicated that MTX was released slowly from the conjugate and longer reside in rabbit. The increased metabolism of MTX after administration of the conjugate could be explained by nonlinear metabolism of MTX and slow release of MTX from the onjugate. It is to be noted that the anounts of MTX remaining in kidney and G-I tract after 30-min infusion of the cnjugate were significantly reduced when compared to the values after administration of free MTX. It is hoped that the administration of MTX-RSA conjugate might reduce the severe side effects of MTX in kidney and G-I tracts. Similar results were also obtained when MTX-HSA conjugate was administered.
The plasma concentrations of 5-FU after 30-min infusion of 5-FU rose rapidly during infusion and declined fast with terminal half-life of 9-min. However, the plasma concentrations of 5-FU after 30-min infusion of 5-FU-AA-HSA conjugate were significantly different. For example, until 2-3 hours post-infusion and fluctuated thereafter up to 8 hours. 5-FU is usually administered every 12 hours. It is hoped that 5-FU-AA-HSA of 12 hour infusion of free 5-FU in order to achieve constant plasma concentration of 5-FU . The amount of 5-FU remaining in brain and mesentery after 30-min infusion of 5-FU-AA-HSA were significantly increased when compared to the values after administration of 5-FU. 5-FU-AA was eliminated quickly with terminal half-life of 15 min.
The toxicities of polylysine conjugates, such as MTX-polylysine and 5-FU-AA-polylysine conjugates, were too high to be used as intravenous infusion, intraperitoneal and subcutaneous injections. - continue -
목차 Contents
- 제 1 장 서론...22
- 제 1 절 알부민 미립구를 이용한 간표적용 서방성 약물수송체의 개발...24
- 제 2 절 Biopolymer를 이용한 약물수송체의 개발...24
- 제 3 절 경구투여용 제어방출성 정제의 개발...29
- 제 2 장 연구방법...32
- 제 3 장 결과 및 고찰...39
- 제 1 절 알부민 미립구를 이용한 간표적용 서방성 약물수송체의 개발 : 항암제 수송체의 개발...39
- 제 2 절 Biopolymer를 이용한 Novel Drug Delivery System의 개발 : 항암제 수송체의 개발...42
- 제 3 절 경구투여용 제어방출형 정제의 개발...46
- 제 4 장 참고문헌...52
- 제 1 장 서 론...74
- 제 2 장 실 험...78
- 제 1 절 실험 재료...78
- 제 2 절 실험 기구 및 기기...80
- 제 3 절 실험 동물...81
- 제 4 절 Adriamycin 의 $[^3H]$ 표지화...81
- 제 5 절 MTX-/$[^3H]$-MTX- HSA Conjugate의 합성...86
- 1. MTX-HSA Conjugate의 합성...86
- 2. $[^3H]$-MTX-HSA Conjugate의 합성...86
- 제 6 절 5-Rl-AA-HSA Conjugate의 합성...88
- 1. 5-FU-AA 의 합성...88
- 2. 5-FU-AA-NHS 의 합성...88
- 3. 5-FU-AA-HSA Conjugate 의 합성...89
- 제 7 절 Conjugate 중의 약물정량...89
- 1. MTX/ $[^3H]$-MTX-HSA Conjugate...89
- 2. 5-FU / 5-FU-AA-HSA Conjugate...91
- 제 8 절 Conjugate 중의 HSA 정량...91
- 제 9 절 알부민 미립구의 제조...91
- 1. 열 고화법 (heat stabilization )에 의한 알부민 미립구의 제조...91
- 가) $[^3H]$-Adriamycin 미립구의 제조...91
- 나) Cytarabine 미립구의 제조...92
- 2. 소수성 미립구의 제조...92
- 가) 5-FU 또는 5-FU-AA-HSA Conjugate 미립구의 제조...92
- 3. 친수성 미립구의 제조...95
- 가) Cytarabine 미립구의 제조...95
- 나) 5-FU/5-FU-AA-HSA Conjugate 미립구의 제조...97
- 다) MTX/MTX-HSA Conjugate 미립구의 제조...98
- 라) $[^3H]$-MTX/$[^3H]$-MTX-HSA Conjugate 미립구의 제조...98
- 제 10 절 미립구중의 약물 봉입량 정량...98
- 1. 미립구 중의 $[^3H]$-Adriamycin 정량...98
- 2. 미립구 중의 Cytarabine 정량...99
- 3. 미립구 중의 5-FU 정량...99
- 4. 미립구 중의 MTX 정량...99
- 5. 미립구 중의 $[^3H]$-MTX 정량...100
- 제 11 절 미립구의 형상 및 입자크기 분포 측정...100
- 1. SEM 법...100
- 2. Coulter Counter 법...100
- 제 12 절 PPO/POPOP Cocktail 조제...101
- 제 13 절 in vitro 방출시험...101
- 제 14 절 Protease에 의한 in vitro 방출시험...101
- 제 15 절 미립구의 Matrix Degradation...102
- 1. SEM 관찰...102
- 2. Turbidity 측정...102
- 제 16 절 Hydrophilicity의 측정...102
- 제 17 절 Aggregation 의 측정...103
- 제 18 절 $[^{99m}$Tc]-표식된 알부민 미립구의 제조...103
- 제 19 절 Gamma-카메라에 의한 Rabbit의 Scanning...105
- 제 20 절 Transmission Electron Microscopy에 의한 간 조직 검사...105
- 제 21 절 $[^3H]$-Adriamycin 미립구의 장기분포 및 소실...105
- 제 22 절 $[^3H]$-MTX 미립구의 장기 분포 및 소실...106
- 제 23 절 HPLC 조건...107
- 제 3 장 결과 및 고찰...109
- 제 1 절 Conjugate 의 합성 결과...109
- 1. MTX-HSA Conjugate 의 합성 결과...109
- 2. 5-FU-AA-HSA Conjugate 외 합성 결과...110
- 제 2 절 미립구의 물리 화학적 성질...110
- 제 3 절 미립구의 형상 및 입자크기 분포...112
- 1. SEM...112
- 2. Coulter Counter 로 측정한 알부민 미립구의 입자 크기 분포...115
- 제 4 절 미립구의 Hyrophilicity...121
- 제 5 절 미립구 현탁액의 안정성 (stability)...121
- 1. 미립구의 Aggregation...121
- 2. 현탁액의 물리적 안정성...124
- 제 6 절 알부민 미립구중의 약물 봉입 효율...124
- 1. Adriamyrcin 봉입 효율...124
- 2. Cytarabine 봉입 효율...126
- 3. 5-FU 봉입 효율...126
- 4. MTX의 봉입 효율...126
- 제 7 절 알부민 미립구로부터의 in vitro 방출...129
- 1. $[^3H]$-Adriamycin 미립구...129
- 2. Cytarabine 미립구...132
- 3. MTX 미립구...132
- 제 8 절 알부민 미립구로부터의 Protease에 의한 in vitro 방출 및 Matrix Degradation...135
- 1. $[^3H]$-Adriamycin 미립구...135
- 2. Cytarabine 미립구...137
- 3. 5-FU, 미립구...141
- 4. MTX 미립구...141
- 5. Protease에 의한 in vitro 방출과정...144
- 제 9 절 $[^{99m}$Tc]-미립구의 Rabbit에서의 장기 분포 특성...147
- 제 10 절 미립구가 Disposition 된 간의 내부 구조...149
- 제 11 절 $[^3H]$-Adriamycin 미립구의 장기 분포 및 소실...149
- 제 12 절 $[^3H]$-MTX 미립구의 분포 및 소실...155
- 1. 투여 후 시간에 따른 분포 특성과 소실 양상...155
- 2. in vitro 방출 특성과 in vivo 에서의 방출과의 상관성...157
- 3. 미립구의 입자크기 분포가 장기표적성에 미치는 영향...162
- 제 4 장 결론...167
- 제 5장 참고문헌...170
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