초록 ▼

1. 형광 Probe의 합성(제1세부과제)
생체세포막등의 친수성 부위(hydrophilic region)에 분포되어 그 부위의 운동등과 같은 각종 정보를 제공해 주는 N-octadecylnaphthyl-2-amine-6-sulfonic acid(ONS)와 생체세포막등의 소수성 부위(hydrophobic region)에 분포될 뿐만 아니라 분자내 excimer를 형성하여 생체세포막등의 측방확산(lateral diffusion)운동정도를 매우 잘 반영해주는 1,3-di(1-pyrenyl)propane(Py-3-Py)을 합성하여

1. 형광 Probe의 합성(제1세부과제)
생체세포막등의 친수성 부위(hydrophilic region)에 분포되어 그 부위의 운동등과 같은 각종 정보를 제공해 주는 N-octadecylnaphthyl-2-amine-6-sulfonic acid(ONS)와 생체세포막등의 소수성 부위(hydrophobic region)에 분포될 뿐만 아니라 분자내 excimer를 형성하여 생체세포막등의 측방확산(lateral diffusion)운동정도를 매우 잘 반영해주는 1,3-di(1-pyrenyl)propane(Py-3-Py)을 합성하여 각가 제2 및 제3세부과제팀에서 이용토록 하였다.
2. SPMV의 지질 조성 분석(제1세부과제)
Cholesterol 대 Phospholipid몰비가 0,59:1 이었고 phosphatidylcholine(42.6%), phosphatidylethanolamine(35.8%) 및 phosphatidylserine(13.6%)이 주된 phospholipid였다. 반면에 phosphatidylinositol(2.9%), sphingomyelin(4.2%) 및 lysophosphatidylcholine(1.0%)은 상대적으로 적게 함유되어 있었으며 phosphatidylglycerol은 측정되지 않았다.
3. SPMV inner와 outer monolayer사이에서의 비대칭적 aminophospholipids 검색(제1세부과제)
Synaptosome의 outer monolayer에 trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS)로 표반응을 일으킨 후에 SPMV를 분리하여 aminophospholipids의 inner와 outer monolayer 사이에서의 비대칭적 분포를 감색한 결과 총 phosphatidylethanolamine(PE)과 총 phosphatidylserine(PS) 중 outer monolayer에는 PE와 PS가 각각 13% 및 20%가 분포되어 있음을 확인하였다.
4. SPMV에서의 개개 인지질 지방산 조성(제1세부과제)
Phosphatidylcholine(PC) 에는 hexadecanoic acid가 40.88%나 조성되어 있었고 PE와 PS에는 octadecanoic acid와 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid가 주로 조성되어 있었다. phosphatidylinositol(PI)에는 octadecanoic acid(35.45%), 5,8,11,14-eicosatetraenoic acid(25.2%) 및 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid(23.25%) 등이 주로 조성되어 있었다. 또 SPMV의 outer monolayer에 분포되어 있는 PE와 PS는 inner monolayer에 분포된 것들에 비하여 보다 포화된 지방산으로 구성되어 있었다.
5. 생체세포막과 인공세포막에서의 Brabiturates 분포(제2세부과제)
생체세포막인 SPMV, SPMV로부터 추출한 총지질로 형성시킨 인공세포막(SPMVTL), 총지질로 부터 분리한 총인지질로 형성시킨 인공세포막(SPMVPL), 총지질로 부터 분리한 PC로 형성시킨 인공세포막(SPMVPC) 및 총지질로 부터 분리한 PE로 형성시킨 인공세포막(SPMVPE)에서의 thiopental sodium, pentobarbital, hexobarbital, amobarital 및 phenobarbital의 침투 분포를 형광소광법(fluorescence quenching method)으로 측정하였다. 그 결과 barbiturates는 주로 친수성 부위에 분포된다는 것을 확인하였고 마취능이 큰 약물일 수록 마취능이 낮은 약물에 비하여 소수성 부위에 침투 분포되는 비율이 높았다.
6. 생체세포막과 인공세포막에서의 n-Alkanols의 침투(제2세부과제)
n-Alkanols가 생체세포막인 SPMV, 인공세포막인 SPMVTL과 SPMVPL 이중층내 소수성부위와 친수성부위에 침투 분포되는 비율을 형광소광법으로 측정하였다. n-alkanols도 대부분이 친수성부위인 막 표면에 분포된다는 것을 알았고 탄소수에 비례하여 소수성부위로 침투되는 비율이 증가하였다.
7. Barbiturates가 생체세포막등의 총측방확산운동에 미치는 영향(제3세부과제)
Barbiturates가 SPMV, SPMVTL, SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS 및 SPMVPI 지질 이중층의 총측방확산(bulk lateral diffusion, inner + outer monolayer의 측방확산) 운동에 미치는 영향을 형과 probe(Py-3-Py) 법으로 측정하였다. 약물을 가하지 않은 생체세포막등의 종류에 따른 총측방확산운동 크기는 SPMVPC > SPMVPI ≥ SPMVPS > SPMVPE > SPMVPL > SPMVTL > SPMV의 순위였다. Barbiturates는 SPMV의 총측방확산운동을 증가시키는 반면에 SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS 및 SPMVPI의 총측방확산 운동을 감소시켰으며 SPMVTL의 총측방확산운동에는 유의할 수 있을 정도의 증감효과는 없었다. Barbiturates가 미치는 SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS 및 SPMVPI 지질 이중층의 총측방확산 운동 감소 효과의 크기는 막 그 자체의 총측방확산 운동의 크기에 비례하였다. 생체세포막인 SPMV, 인공세포막인 SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS 및 SPMVPI의 총측방확산운동 증감효과에 미치는 barbiturates끼리의 상대적 효과 순위는 마취효과 크기와 일치하였다.
8. n-Alkanols가 생체세포막등의 총측방확산운동에 미치는 영향 (제3세부과제)
n-Alkanols가 SPMV, SPMVTL 및 SPMVPL 지질 이중층의 총측방확산운동에 미치는 영향을 Py-3-Py를 이용하여 형광분석법으로 측정하였다. n-Alkanols가 SPMV, SPMVTL 및 SPMVPL 이중층의 총측방확산운동을 증가시켰고 막종류에 따른 총측방확산 운동 증가 효과의 크기는 SPMV > SPMVTL > SPMVPL 의 순위였다.
9. Barbiturates가 생체세포막과 인공세포막의 총회전확산운동(bulk rotational diffusion, inner + outer monolayer)에 미치는 영향(제4세부과제)
Barbiturates가 생체세포막인 SPMV, 인공세포막인 SMVTL, SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS 및 SPMVPI 지질 이중층의 총회전확산운동에 미치는 영향을 형광 probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene(DPH)을 통한 형광분석법으로 검색하였다. barbiturates가 첨가되지 않은 막 자체끼리의 총회전확산운동 상태의 상대적 크기는 제3세부과제팀에서 연구한 총측방확산운동의 상대적 크기와 마찬가지로 SPMVPC > SPMVPI ≥ SPMVPS > SPMVPE > SPMVPL > SPMVTL > SPMV의 순위였다. barbiturates 종류에 따른 총회전확산운동 증감효과의 크기는 마취 효과의 크기와 일치하여 pentobarbital > hexobarbital > amobarbital > phenobarbital의 순위였다.
10. n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 총회전확산운동에 미치는 영향(제4세부과제)
n-Alkanols가 SPMV, SPMVTL 및 SPMVPL 지질 이중층의 총회전확산운동에 미치는 영향을 형광 probe DPH를 통하여 형과분석법으로 측정하였다. n-Alkanols는 SPMV등의 총회전확산운동을 증가시켰으며 탄소수에 비례하여 그 효력이 증가되 탄소수가 두개 증가될 때에 그 효력이 약 10배 정도가 증가되었다.

Abstract ▼

1. Synthesis of Fluorescent Probes (First Subject)
N-octadecylnaphthyl-2-amine-6-sulfonic acid (ONS) and 1,3-di(1-pyrenyl) propane (Py-3-Py) were synthesized, which were used in the second and third subjects.
2. General Lipid Composition of SPMV (First Subject)
The cholesterol t

1. Synthesis of Fluorescent Probes (First Subject)
N-octadecylnaphthyl-2-amine-6-sulfonic acid (ONS) and 1,3-di(1-pyrenyl) propane (Py-3-Py) were synthesized, which were used in the second and third subjects.
2. General Lipid Composition of SPMV (First Subject)
The cholesterol to phospholipid molar ratio was 0.59:1, and the major phospholipids were phosphatidylcholine (PC, 42.6%), phosphatidylethanolamine (PE, 35.8%), and phosphatidylserine (PS, 13.6%). Phosphatidylinositol (PI, 35.8%), sphingomyelin (4.2%), and lysophosphatidylcholine (1,0%) were relatively minor components while phosphatidylglycerol was absent.
3. Aminophospholipid Asymmetry in SPMV (First Subject)
The asymmetric distribution of aminophospholipids in SPMV was determined by a chemical labelling procedure. Under nonpenetrating conditions (4 ℃), bovine brain synaptosomes were treated with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) to label outer monolayer aminophospholipids covalently. About 13% of PE ann 20% of PS were found to be in the outer monolayer of SPMV.
4. Acyl Group Composition of Individual Phospholipids in SPMV : Acyl Group Asymmetry of PE and PS (First Subject)
Each phospholipid class showed a specific fatty acid composition which differed from that of the other phospholipids. PC contained high levels of hexadecanoic acid (40.88%). The PE and PS had octadecanoic acid and 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid as the major components. The trinitrophenylated PE and PS (outer monolayer ) consisted of more saturated fatty acid than did the unlabelled PE and PS (inner monolayer), In PI, octadecanoic acid (35 45%), 5,8,11,14-eicosatetraenoic acid (25.2%), and 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (23.25%) were the major components.
5. Penetration of Barbiturates into SPMV and Model Membranes (Second Subject)
The degree of penetration of barbiturates into SPMV and model membranes was determined by modified Stern-Volmer equation. Model membranes include the liposomes of total lipids (SPMVTL), phospholipids (SPMVPL), PC fraction (SPMVPC), and PE fraction (SPMVPE) extracted from SPMV, The two fluorescent probes ONS and 12-(9-anthroyl)stearic acid (AS) were utilized as probes for the surface of the membrane and the hydrocarbon interior of the membrane bilayer, respectively. The analysis of preferential quenching of these probes by barbiturates indicates that barbiturates were predominantly distributed in the hydrophilic sites of the membranes, and yet barbiturates with higher anesthetic activity resulted in the more effective Fnetration into the membrane bilayer.
6. Penetration of n-Alkanols into SPMV and Model Membranes (Second Subject)
The degree of penetration of n-alkanols into SPMV and model membranes was also determined by fluorescent quenching. n-Alkanols are predominantly distributed on the surface area as well. Their penetration into the membrane bilayers increased with the carbon chain length. The order was: methanol > ethanol > 1-propanol > 1-butanol > 1-pentanol > 1-hexanol > 1-heptanol > 1-octanol > 1-nonanol > 1-decanol. The order of membranes was: SPMVPL > SPMVTL > SPMV.
7. Effects of Barbiturates on the Excimer to Monomer Fluorescence Intensity Ratio of Py-3-Py in SPMV and Model Membranes (Third Subject)
The effects of barbiturates on the excimer to monomer fluorescence intensity ratio (I'/I) of Py-3-Py were investigated in SPMV and model membranes. Intramolecular excimer formation of Py-3-Py reflects the lateral diffusion of the fluorophores. At 37-C, the control values of the probe molecule in the membranes were in the order : SPMVPC > SPMVPI 2 SPMVPS > SPMVPE > SPMVPL > SPMVTL > SPMV. Barbiturates fluidized intact SPMV, had ordering effects on SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS and SPMVPI in a dose-dependent anner, and had little effects on SPMVTL.
8. Effects of n-Alkanols on the Excimer to Monomer Fluorescence Intensity Ratio of Py-3-Py in SPMV and Model Membranes (Third Subject)
The effects of n-alkanols on the excimer to monomer fluorescence intensity ratio of Py-3-Py were investigated in SPMV, SPMVTL, and SPMVPL. In contrast to barbiturates, n-alkanols increased the I'/I values in all membranes. Compared with the intact SPMV, SPMVTL were less sensitive to n-alkanols.
9. Effects of Barbiturates on the Fluorescence Polarization of DPH in SPMV and Model Membranes (Fourth Subject)
The fluorescence polarization assesses rotational diffusion of lipid fluorophores. The effects of barbiturates on the fluorescence polarization of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (MH) were determined in SPMV and model membranes. The result was in consistent with that obtained by excimer fluorescence technique. Barbiturates decreased the fluorescence parameters of DPH in intact SPMV in a dose-dependent manner. In contrast, they did not affect the parameters of MH in the liposomes of SPMVTL and even dose-dependently increased the parameters of DPH in the liposomes of SPMVPL, SPMVPC, SPMVPE, SPMVPS and SPMVPI. In addition, the membrane-ordering effects of barbiturates correlated with the initial fluidity of the membranes. The membrane-perturbing potencies were in the order : pentobarbital > hexobarbital > amobarbital > phenobarbital. At 37℃, the fluorescence parameters of MH followed the order : SPMV > SPMVTL > SPMVPL > SPMVPE > SPMVPS ≥ SPMVPI > SPMVPC. Thus, this experiment confirms that barbiturates function to modulate the fluidity of neuronal membranes: barbiturates fluidize the ordered membranes and order the fluid membranes.
10. Effects of n-alkanols on the Fluorescence Polarization of DPH in SPMV and Model Membranes.(Fourth Subject)
The effects of n-alkanols on the fluorescence polarization of M H were also determined in SPMV, SPMVTL, and SPMVPL. The result was also in agreement with that obtained by excimer fluorescence technique.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...23
• 제 2 장 방 법...29
• 제 1 절 SPMV의 분리법 개발...29
• 제 2 절 인공세포막 제제...30
• 제 3 절 Py-3-Py와 ONS 합성...30
• 제 4 절 SPMV 및 인공세포막 outer monolayer에의 TNBS 표지 반응과 그 확인...30
• 제 5 절 SPMV의 지질 조성 분석...31
• 제 6 절 생체세포막과 인공세포막에의 probe 봉입...31
• 제 7 절 형광 측정...31
• 제 8 절 생체세포막과 인공세포막에로의 BBT와 n-Alkanols의 침투 분포...31
• 제 9 절 BBT와 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 총측방확산운동에 미치는 영향...32
• 제 10 절 BBT와 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 총회전확산운동에 미치는 영향...32
• 제 11 절 BBT와 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 inner와 outer monolayer사이에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적영향...32
• 제 3 장 결과 및 고찰...34
• 제 1 절 SPMV의 분리법...34
• 제 2 절 형광 probe Py-3-Py와 ONS의 합성...35
• 제 3 절 SPMV 지질 조성...36
• 제 4 절 생체세포막과 인공세포막에서의 BBT 침투 분포...37
• 제 5 절 생체세포막과 인공세포막에서의 n-Alkanols 침투 분포...38
• 제 6 절 BBT가 생체세포막과 인공세포막의 총측방확산운동에 미치는 영향...38
• 제 7 절 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 총측방확산 운동에 미치는 영향...39
• 제 8 절 BBT가 생체세포막과 인공세포막의 총회전확산운동에 미치는 영향...39
• 제 9 절 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 총회전확산 운동에 미치는 영향...40
• 제 10 절 BBT가 생체세포막과 인공세포막의 inner와 outer monolayer간에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적 영향...41
• 제 11 절 n-Alkanols가 생체세포막과 인공세포막의 inner와 outer monolayer사이에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적 영향...41
• 제 4 장 결 론...43
• REFERENCES...51
• 제 1 장 서 론...59
• 제 2 장 방 법...64
• 제 1 절 SPMV의 분리법 개발...64
• 제 2 절 형광 probe Py-3-Py와 ONS 합성 및 그 확인...69
• 제 3 절 SPMV, SPMVTL 및 SPMVPL outer monolayer에의 TNBS 표지반응, 그 확인 및 SPMV분리...70
• 제 4 절 SPMV의 지질조성 및 aminophospholipides의 inner와 outer monolayer간의 비대칭성 검색...72
• 제 5 절 BBT와 n-Alkanols가 SPMVTL 및 SPMVPL inner와 outer monolayer간에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적 영향...73
• 제 3 장 결과 및 고찰...78
• 제 1 절 SPMV 분리법 개발...78
• 제 2 절 형광 probe Py-3-Py와 ONS합성...79
• 제 3 절 SPMV의 지질 조성 분석...80
• 제 4 절 SPMV inner와 outer monolayer 사이에서의 비대칭적 aminophospholipides 검색...81
• 제 5 절 SPMV 개개 인지질의 지방산 및 비대칭적으로 분포된 aminophospholipides의 지방산 조성...82
• 제 6 절 BBT가 SPMV, SPMVTL 및 SPMSVPL inner와 outer monolayer 간에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적 영향 및 TMA-DPH와 PRO-DPH를 이용한 SPMV의 비대칭적 회전확산운동 유무 확인...83
• 제 7 절 n-Alkanols가 SPMV, SPMVTL 및 SPMVPL의 inner와 outer monolayer간에 형성된 비대칭적 회전확산운동에 미치는 비대칭적 영향...86
• 제 4 장 결 론...186
• REFERENCES...190