초록 ▼

곤충 세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산을 위한 생물 반응기의 개발을 위하여 본 연구를 수행하였다. Spdoptera frugiperda 21 세포는 pH 6.2, 80 rpm의 교반속도 그리고 0.3％Pluronic F-68이 첨가된 배지에서 잘 성장하였고 5％ FBS를 포함한 Grace 배지를 이용한 경우 Sf-900 및 EX-400 무혈청 배지에서 보다 성장이 우수한 것으로 나타났다. 재조합 β-galactosidase 생산은 CaCl?, 감염시의 세포농도, 통기량에 영향을 받았으나 methylamine과 chloroq

곤충 세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산을 위한 생물 반응기의 개발을 위하여 본 연구를 수행하였다. Spdoptera frugiperda 21 세포는 pH 6.2, 80 rpm의 교반속도 그리고 0.3％Pluronic F-68이 첨가된 배지에서 잘 성장하였고 5％ FBS를 포함한 Grace 배지를 이용한 경우 Sf-900 및 EX-400 무혈청 배지에서 보다 성장이 우수한 것으로 나타났다. 재조합 β-galactosidase 생산은 CaCl?, 감염시의 세포농도, 통기량에 영향을 받았으나 methylamine과 chloroquine은 β-galactosidase 생산을 높이는데 효과적이지 못했다. 곤충 세포의 연속 배양 시스템은 회분식 형태의 생물 반응기를 변형하여 구성하였으며 최대 β-galactosidase 생산량은 dilution rate 0.006 hr?? 에서 14 U/㎖ 으로 나타났다. 곤충세포 배양및 재조합 단백질 생산용 Perfusion 생물 반응기 시스템으로 2가지 형태를 조사하였는데 하나는 cell-precipitator bioreactor이며 perfusion rate 0.011 hr??에서 세포의 농도는 1 X 10? cells/㎖ 이었고 재조합 β-galactosidase 생산량은 50 units/㎖ 이었다. 그러나 cell precipitator bioreactor는 perfusion rate를 크게 증가시켰을때 완전한 perfusioin 시스템이 되지 못하였다. 다른 perfusion 시스템인 spin-filt3er bioreactor의 경우에는 perfusion rate 0.061 hr??에서도 세포의 농도 및 재조합 β-galactosidase 생산량을 높게 유지할 수 있었다. 특히 이러한 시스템에서 80 rpm 의 교반및 표면통기(surface aeration), Grace배지를 이용한 경우 재조합 β-g al 생산이 우수한 것을 나타났다. 아울러 15 ㎛의 spin-filter를 사용한 경우 filter fouling 현상이 크게 경감되어 spin-filter bioreactor는 곤충세포 배양에 적합한 perfusion 시스템으로 확인되었다.

Abstract ▼

These studies were carried out to establish bioreactor systems for the production of recombinant proteins using insect cells. The Spodoptera frugiperda 21 cells grew well at pH 6.2, 80 rpm agitation, and in the presence of 0.3％ Pluronic F-68. The cell growth was better in Grace medium containing

These studies were carried out to establish bioreactor systems for the production of recombinant proteins using insect cells. The Spodoptera frugiperda 21 cells grew well at pH 6.2, 80 rpm agitation, and in the presence of 0.3％ Pluronic F-68. The cell growth was better in Grace medium containing 5％ FBS than that in EX-CELL 400 or Sf-900 serum-free medium. The level of CaCl?, cell density at infection, and aeration rate affected recombinant β-galactosidase production. Methylamine and chloroquine did not significantly influence reconbinant β-galactosidase production. The set-up for batch culture was modified for continuous culture system, in which the maximum β-galactosidase production of 14 U/㎖ was achieved at the dilution rate of 0.006 hr??. Two kinds of perfusion bioreactor were tested for insect cell cultivation and recombinant protein production. One is the cell precipitator bioreactor, in which the cell concentration was 1 x 10? cells/㎖ and the amount of β-galactosidase was 17 U/㎖ at the perfusion rate of 0.011 hr??. But this bioreactor could not achieve complete perfusion at the higher dilution rate. The other is the spin-filter bioreactor, in which the cell concentration and the amount of β-galactosidase production were higher even at the perfusion rate of 0.061 hr??. Especially increased β-galactosidase production was obtained at 80 rpm and surface aeration in Grace medium. Furthermore, filter fouling problems were alleviated using 15㎛ spin-filter and spin-filter bioreactor was proven to be an adequate perfusion system for insect cell culture.

목차 Contents

• I. 서 언...11
• II. 재료 및 방법...13
• III. 결과 및 고찰...15
• 1. 곤충세포의 배양용 저가격 배지 개발에 관한 연구...15
• 1.1 저혈청 배지 및 혈정 대용제의 연구...15
• 1.2 저혈청 배지의 실용서 조사...15
• 1.3 무혈청 배지 연구...15
• 2. 곤충세포의 회분식 배양 kinetics의 연구...15
• 2.1 seeding density 및 배지의pH가 곤충세포에 미치는 영향 조사...15
• 2.2 교반속도의 변화와곤충 세포의 성장과의 관계 조사...16
• 2.3 보호제에 의한 shear로부터의 곤충 세포의 방호 효과 조사...16
• 2.4 배지 조성이 세포 성장에 미치는 영향 조사...16
• 2.5 세포 배양시 용존산소 및 redox potential의 관계 조사...16
• 2.6 곤충 세포의 대사산물이 곤충세포에 미치는 영향 조사...17
• 2.7 재조합 단백질 생산에 대한 기타 환경 인자의 영향...17
• 2.7.1 통기량...17
• 2.7.2 감염 배지풍의 $CaCl_2$농도...18
• 2.7.3 Lysosomotropic agent...18
• 2.7.4 영양 요구성...18
• 2.7.5 감염시의 세포 농도...19
• 3. 곤충세포의 연속식 배양에 관한 연구...19
• 3.1 연속식 배양 시스템의 확립 및 세포 배양...19
• 3.2 Dilution rate와 세포의 농도와 재조합 단백질 생산성과의 관계 연구...19
• 4. 곤충세포의 고농도 배양을 위한 perfusion 배양 시스템의 설계 및 feasibility 조사...19
• 4.1 Cell-precipitator에 의한 perfusion 배양 시스템의 feasibility 조사...20
• 4.2 Spin-filter를 이용한 persusion 배양 시스템의 feasibility 조사...20
• 5. Cell-percipitator를 이용한 perfusion 배양 시스템에 의한 곤충 세포의 배양 및 재조합 단백질 생산에 관한 연구...20
• 5.1 Cell-percipitator bioreactor 시스템에 의한 perfusion 배양 시스템에 의한 곤충세포의 배양 및 재조합 단백질 생산 연구:Dilution rate의 영향조사...20
• 5.2 Cell-percipitator bioreactor 시스템의 실용성 조사...20
• 6. Spin-filter bioreactor를 이용한 perfusion 배양 시스템에 의한 곤충 세포의 배양 및 재조합 단백질 생산에 관한 연구...21
• 6.1 Spin-filter bioreactor 시스템에서 세포 배양 및 recombinant baculovirus에 의한 재조합 단백질 생산에 관한 연구 : spin-filter 회전 속도의 영향...21
• 6.2 Spin-filter bioreactor 시스쳄에서 세포수율 및 recombinant baculovirus에 의한 재조합 단백질 생산성 향상 연구...21
• 7. Recombinant baculovirus에 의한 단백질 대량생산 시스템의 실용화 연구...22
• 7.1 재조합 단백질의 대량 생산 최적 조건 검토 : Perfusion rate 조절 방법의 변화와 재조합 단백질 생산과의 관계 조사...22
• 7.2 Perfusion 배양 시스템의 실용화 및 scale-up시의 문제점 확인: Filter fouling 연구...23
• IV. 결언...24
• 인용문헌...63
• 논문발표실적...65
• 학위배출실적...66