초록 ▼

본 연구는 B형 간염 바이러스(HBV)의 핵단백질을 vaccinia 바이러스 벡터를 이용하여 발현시키고, 발현된 핵단백질의 생화학적 특성 연구를 주된 내용으로한다. 우리나라에서 많은 adr아형의 HBV DNA를 환자 혈청으로부터 PCR cloning 하고이로부터 핵단백질을 발현하는 core 및 precore-core 유전자를 vaccinia 벡터인 pMJ601에subcloning 하였다. CV-1 cell 에 vaccinia 바이러스(WR) 를 감염시키고 이 plasmid 를transfection 하여 바이러스를 수거

본 연구는 B형 간염 바이러스(HBV)의 핵단백질을 vaccinia 바이러스 벡터를 이용하여 발현시키고, 발현된 핵단백질의 생화학적 특성 연구를 주된 내용으로한다. 우리나라에서 많은 adr아형의 HBV DNA를 환자 혈청으로부터 PCR cloning 하고이로부터 핵단백질을 발현하는 core 및 precore-core 유전자를 vaccinia 벡터인 pMJ601에subcloning 하였다. CV-1 cell 에 vaccinia 바이러스(WR) 를 감염시키고 이 plasmid 를transfection 하여 바이러스를 수거한 뒤 HuTK-143B cell 에서 BrdU(Bromodeoxy Uridine)로 재조합 vaccinia 바이러스를 selection 함으로써 핵(core) 단백질을 발현하는 재조합vaccinia 바이러스(VV-HBVC)를 얻었다. 이 바이러스를 HuTK-143B cell 에 감염시켜서핵단백질의 발현 여부와 capsid formation 여부, 그리고 세포 내에서의 위치 등을 조사하였다. Western blot 에 의한 분석 결과 VV-HBVC 는 21kD 의 핵단백질을 발현하며 발현된핵단백질은 배양액 중으로는 거의 secretion 되지 않음을 확인하였다. 세포 내에서 발현된핵단백질의 위치를 알아보기 위해서 VV-HBVC 로 감염된 세포를 freezing/thawing 하여원심분리에 의해 세포질과 핵으로 나누어 Western blot 해본 결과 99% 이상이 세포질에 존재하는 것으로 확인되었으며 극미량은 핵으로도 이동하는 것으로 추정되었다. 세포질로부터 회수한 핵단백질을 CsCl gradient 를 이용하여 초고속원심분리하였을 때 대부분이capsid complex 를 형성하여 약 1.3g/ml 정도의 밀도를 가지는 fraction 에서 발견되었다.그 외에도 1.22g/ml, 1.16g/ml 정도의 밀도를 가지는 fraction 에서도 검출되었는데 이들은capsid formation이 완전히 끝나지 않은 중간산물과 monomer 로 존재하는 단백질로 추정되었으나 그 양이 capsid complex 를 이룬 양과 비교해볼 때 극히 적은 것으로 보아 발현된대부분은 capsid complex 의 형태로 존재한다는 것을 알 수 있었다.이에 비해 precore-core 단백질을 발현하는 재조합 vaccinia 바이러스를 제조하는 일은순조롭지 않았다. 즉, pMJ601 vector 를 이용한 재조합 vaccinia 바이러스의 제조는 성공적이지 못했는데 이는 아마도 외부 유전자의 발현 양이 많기 때문에 숙주세포에 어떤stress 를 주기 때문일 것으로 추정되었다. 따라서 상대적으로 발현 양이 적은 vacciniavector 인 pSC11 을 이용하여 재조합 vaccinia 바이러스를 제조하였다.

Abstract ▼

The present study was aimed at the expression andcharacterization of the hepatitis B virus core protein by vaccinia virus vector. Thegenome of adr type, the most prevalent type of HBV in Korea, was cloned by PCRfrom patient sera and the core gene was subcloned into the vaccinia ve

The present study was aimed at the expression andcharacterization of the hepatitis B virus core protein by vaccinia virus vector. Thegenome of adr type, the most prevalent type of HBV in Korea, was cloned by PCRfrom patient sera and the core gene was subcloned into the vaccinia vector pMJ601.Cultured CV-1 cells were infected by vaccinia virus(WR) and transfected with therecombinant plasmid pMJC. Amplified viruses were harvested, plaqued on HuTK-143Bcells and selected by BrdU. In this way the VV-HBVC, the recombinant vacciniavirus expressing HBV core protein, was acquired. We examined whether core proteinwas expressed and capsid formation was occurred in HuTK-143B cells. Immunoblotanalysis of the cell proteins infected by VV-HBVC indicated that the core protein(21kD)was expressed in the virus infected cell and was not secreted into the culture medium.In order to examine the distribution of the core protein, infected cells were frozen andthawed three times and centrifuged briefly to separate the cytoplasmic supernatant andthe nuclear pellet. We found that more than 99% of the core proteins were detected inthe cytoplasm. When the core proteins from the cell cytoplasm was furtherfractionated by CsCl density gradient analysis, the core protein sedimented to thefractions with density about 1.3g/ml, indicating that the majority of the core proteinsexist as a capsid complex in the cell cytoplasm. In addition to these fractions,fractions with density of 1.22g/ml and of 1.16g/ml were also detected although the levelof the core protein in these fractions was very low. These additional fractions werethought to be intermediates and monomers. We concluded that most core proteinswere capsid form in the VV-HBVC infected cells.It was not easy to generate recombinant vaccinia virus expressing precore proteins.Because the pMJ601 have a very strong promoter, high level expression of the precoreproteins may be stressful to the host cells thus, recombnant vaccinia viruses expressingprecore proteins(VV-HBVPC1) were generated by pSC11 vector which contains avaccinia weak promoter.

목차 Contents

• - 목 차 -...6
• I. 서론...7
• 1. 연구의 배경...7
• 2. 연구의 중요성 및 목적...7
• II. 연구방법 및 이론...8
• 1. HBV core recombinat plasmid 의 제조...8
• 2. Recombinant vaccinia virus 의 제조...8
• 3. Core 단백질 발현 분석...9
• 4. CsCl density gradient 에 의한 capsid analysis...13
• III. 결과...13
• 1. Recombinant virus 의 분리...13
• 2. Core 단백질의 발현...14
• 3. Capsid formation analysis...14
• 4. Core 단백질의 세포내 위치 분석...17
• IV. 고찰 및 결론...17
• V. 인용문헌...19