초록 ▼

미생물이 생산하는 D-xylose isomerase(XI)는 포도당을 과당으로이성화할 수 있기 때문에 glucose isomerase(GI)라고도 부르며 전분의 가수분해물로 부터감미제인 HFGS(high fructose glucose syrup) 생산공업에 대량으로 사용되고 있는 것은 물론 그 유전자를 효모에 클로닝하므로써 헤미셀룰로스 가수분해물의 주성분인 D-xylose로부터 알코올을 생산하여 대체에너지로 사용할 수 있다는 가능성 등으로 매우 중요한 효소의 하나이다.본 연구실에서 분리한 방선균 Streptomyces ch

미생물이 생산하는 D-xylose isomerase(XI)는 포도당을 과당으로이성화할 수 있기 때문에 glucose isomerase(GI)라고도 부르며 전분의 가수분해물로 부터감미제인 HFGS(high fructose glucose syrup) 생산공업에 대량으로 사용되고 있는 것은 물론 그 유전자를 효모에 클로닝하므로써 헤미셀룰로스 가수분해물의 주성분인 D-xylose로부터 알코올을 생산하여 대체에너지로 사용할 수 있다는 가능성 등으로 매우 중요한 효소의 하나이다.본 연구실에서 분리한 방선균 Streptomyces chibaensis J-59가 생산하는 XI는 유도물질로써 고가의 D-xylose를 사용하지 않고 xylan으로 대체하여 생산가능하며 지금까지 보고된 어떤 방선균의 XI보다 내열성이 강하다. S. chibaensis J-59의 내열성 XI(GI)의 생산을 위한 플라스크 및 jar fermenter 배양에서의 최적조건을 검토하였으며, 그 결과 배양액㎖당 7.43GIU를 생산할 수 있었다. S. chibaensis J-59가 생산하는 XI를 정제하여 그 특성을 조사한 결과 최적온도는 85℃이였고, 열 안정성은 85℃까지 안정하였다. Co2+ 존재하에서 본 효소의 열 안정성을 보면 85℃에서의 반감기가 13.5시간이며 90℃에서는 126분으로 열안정성이 우수하였다. 순수하게 정제된 S. chibaensis J-59의 XI는 분자량이SDS-PAGE에서 45kDa,gel filteration에서 180kDa로 나타나 4개의 동일한 서브유니트로 구성되어 있었다.S. chibaensis J-59의 XI유전자(xylA)를 클로닝하고 염기서열을 결정하여 대장균 및방선균에 서브 클로닝하여 발현시켰다. 클로닝된 xylA 유전자의 coding region은 ATGcodon으로부터 TGA codon까지를 포함하여 1167bp (No. 552∼1718)이었으며 388개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 아미노산 배열로부터 계산한 분자량은 42,989Da이었다.xylA 구조 유전자의 염기조성을 분석한 결과, A는 183개(15.68%), T는 153개(13.11%), G는386개 (33.07%), 그리고 C는 445개(38.13%)이었으며, xylA 유전자에서 codon의 세번째 염기의 G+C의 함량이 96.4%로 전형적인 방선균 유전자의 특성을 나타내었다. xylA 유전자의 ATGcodon의 7bP 상류에 ribosome binding site로 추정되는 5'-AAGGAG-3' 서열이 존재하였으며, 52bp 상류에 프로모터로 추정되는 2개의 hexamer배열인 CATACT(-10)와TTGTCT(-35)가 19bp를 사이에 두고 존재하였다. 또 xylA 유전자의 TGA 번역종지codon의 9bP 하류에 transcriptional terminator로 추정되는 14bp의 inverted repeat 염기서열이 존재하였다.S. chibaensis J-59의 xylA 유전자를 대장균 발현벡터인 pT7-7 및 pET 플라스미드의T7 phage Φ10 프로모터 하류의 multicloning site에 서브클로닝하여 증폭생산(최고8.48GIU)에 각각 성공하였다. 방선균에서 xylA 유전자의 발현을 위해 S. lividans 1326으로부터 xylA 변이주를 분리하고 방선균-대장균 셔틀벡터인 pWHM3에 xulA 유전자를 서브클로닝하여 발현시켜 친주인 S. lividans 1326보다 약 3배, S. chibaensis J-59보다 약 2배의효소를 생산하였다. 대장균 및 방선균에서 발현된 효소는 친주의 것과 최적pH, 최적온도및 내열성이 동일하였다.

Abstract ▼

Xylose isomerase(D-xylose ketol-isomerase; E.C. 5. 3. 1. 5 ;XI) can catalyze the isomerization of D-xylose to D-xylulose and D-glucose toD-fructose, commonly referred to as a glucose isomerase(GI) which is one of the mostimportant industrial enzymes in the commercial conversion of star

Xylose isomerase(D-xylose ketol-isomerase; E.C. 5. 3. 1. 5 ;XI) can catalyze the isomerization of D-xylose to D-xylulose and D-glucose toD-fructose, commonly referred to as a glucose isomerase(GI) which is one of the mostimportant industrial enzymes in the commercial conversion of starch to high fructoseglucose syrups.The optimal condition for the GI(or XI) production from Streptomyces chibaensisJ-59 was attained in a culture medium composed of 1% birchwood xylan, 1.5% cornsteep liquor, 0.1% MgS04·7H20, 0.012% CoCl2·6H20, and 0.15% glucose(CSL medium).The production of enzyme reached to a maximum level when bacteria were culturedfor 42hrs at 30℃ and pH 7.0. The estimated optimum conditions in jar fermentorwere as follows : 1% birchwood xylan, 1.5% CSL, 0.1% MgS04·7H20, 0.012%, CoCl2·6H20, 0.586% g1ucose, 2.2 vvm of air flow, and 587 rpm of agitation speed, at pH 7.0.The GI from S, chibaensis J-59 was purified to be homogeneous on SDS-PAGE byammonium sulfate fractionation, heat treatment, column chromatography onDEAE-cellulose and gel filtration on Sephacryl S-300. The optimum temperature forthe activity was 85℃. The enzyme was highly thermostable, so it was not denaturedby the heat-treatment for 2hrs at 85℃ in buffer containing Co2+ and about 50% ofactivity was retained on the heat-treatment at 90℃ for 126min. The NH2-terminalsequence of 14 amino acid residues of XI from S, chibaensis J-59 was determined to beH2N-Ser- Tyr-Gln-Pro-Thr-Pro-Glu-Asp-Arg-Phe-Thr-Phe-Gly-Leu. We havecloned the gene for XI, xylA, as a 5kb BamH 1 fragment from S. chibaensis J-59chromosomal DNA. The coding region of S. chibaensis J-59 XI is 1167bp from thestart codon ATG to the stop codon TGA coding 388 amino acid residues. The aminoacid sequences inferred from the DNA sequence are in good agreement with thoseexpected bases on biochemical chracterization of S. chibaensis J-59 GI, including overallamino acid composition and N-terminal amino acid sequences. From the deducedamino acid sequence, the molecular mass of the peptide was calculated to be 42,989Da.The base composition of S. chibaensis J-59 XI gene are 183 A(15.68%), 153 T(83.11%),386 G(33.07%), and 445 C (38.13%). The G+C content of the gene was 71.2%, in amole, and the probability of G or C on the third wobble position of the codon was96.4%. The S, chibaensis J-59 enzyme shares 96.4% identical amino acid residueswith S. olivochromogenes. The putative ribosome binding sequence(AAGGAG) wasfound in 7bp upstraem from ATG codon. Although the initiation site for transcriptionhas not yet been found, two hexameric consensus sequences, -10(CATACT) and-35(TTGTCT) regions spaced by 19bp, existed at 52bp upstream from ATG codon.The gene encoding GI of S. chibaensis J-59 was expressed and amplified the GIproduction by using a T7 promoter in an expression vector pT7-7 and pET. Thecharacterization of the expressed proteins were identical to those of the purified Xl of S.chibaensis J-59.

목차 Contents

• 서론...8
• 재료 및 방법...10
• 1. 배지...10
• 2. 효소 활성의 측정...10
• 가. Glucose isomerase...10
• 나. Xylose isomerase...10
• 3. 단백질의 정량...10
• 4. D-Xylose isomerase의 생산을 위한 배양 조건...11
• 가. 플라스크 배양...11
• 나. Jar fermentor 배양...11
• 5. 효소의 정제 및 특성 조사...11
• 가. 효소의 정제 방법...11
• 나. Polyacrylamide gel 전기영동...11
• 다. 분자량 측정...11
• 라. 아미노산의 조성 분석 및 효소 단백질의 N-말단 아미노산의 서열결정...12
• 6. D-Xylose isomerase 유전자(xylA)의 클로닝 및 염기서열 분석...12
• 가. 균주 및 플라스미드...12
• 나. 방선균으로 부터 염색체 DNA 분리...13
• 다. 플라스미드 DNA의 분리 및 전기영동...13
• 라. DNA 절단 및 DNA 단편의 분리...13
• 마. 대장균 및 방선균에 형질전환...13
• 바. Polymerase chain reaction(PCR) 조건...13
• 사. Southern hybridization과 colony hybridization...13
• 아. DNA 염기서열 분석...13
• 자. 방선균의 xylA 변이주의 선발...13
• 차. xylA 유전자의 대장균에서의 발현...14
• 결과 및 고찰...15
• 1. 균의 분리 및 동정...15
• 2. D-Xylose isomerase의 최적 생산 조건...15
• 가. 플라스크 배양...15
• 나. Jar fermentor 배양...16
• 3. 내열성 D-xylose isomerase의 정제 및 특성...18
• 가. 효소의 정제 및 순도 확인...18
• 나. 정제 효소의 분자량...20
• 다. 기질 농도의 영향...20
• 라. 금속 이온의 영향...20
• 마. 효소 저해제의 영향...21
• 바. 최적 pH 및 pH 안정성...21
• 사. 최적 온도 및 열 안정성...21
• 아. 열 안정성에 미치는 Co$^{2+}$의 영향...23
• 자. 포도당의 이성화율...25
• 차. 효소 단백질의 아미노산 조성 및 N-말단 아미노산의 서열...25
• 4. S. chibaensis J-59 D-xylose isomerase 유전자(xylA)클로닝 및 염기서열...26
• 가. S. chibaensis J-59 염색체 DNA의 PCR...26
• 1) PCR 프라이머...26
• 2) PCR 산물의 클로닝 및 염기서열...26
• 나. 염색체 DNA로부터 xylA 유전자의 분리...28
• 1) 염색체 DNA library의 조제...28
• 2) Colony hybridization에 의한 xylA 함유 클론의 분리...29
• 3) xylA 유전자의 서브 클로닝 및 염기서열...29
• 다. xylA 유전자의 방선균에서의 발현...35
• 라. xylA 유전자의 대장균에서의 발현...37
• 결론...41
• 인용문헌...44
• 연구수행관련 논문발표 목록서...47
• 자체평가서...48