초록 ▼

각종의 동물에서 다양한 유전자변환 동물의 가능성 및 실제적인유용산물의 생산예가 보고되었으며, 다양한 종, 다량의 산란 난자수, 산업적 가치등에 의해,유전자변환 어류에 대한 관심과 그 필요성은 날로 증가 추세에 있으며 많은 관련 연구가 수행되어져 왔다. 그러나 유전자 변환 어류를 생산하는데 사용되는 방법중 하나인 미세주입법은 여러 가지 어려운점과 문제점을 가지고 있으므로 이를 극복하고 보다 효율적인 유전자도입방법을 개발코자 어류 정자-DNA 결합에 의한 외래 유전자 도입방법의 개발과 그 결합능을 증대시키기 위한 electrop

각종의 동물에서 다양한 유전자변환 동물의 가능성 및 실제적인유용산물의 생산예가 보고되었으며, 다양한 종, 다량의 산란 난자수, 산업적 가치등에 의해,유전자변환 어류에 대한 관심과 그 필요성은 날로 증가 추세에 있으며 많은 관련 연구가 수행되어져 왔다. 그러나 유전자 변환 어류를 생산하는데 사용되는 방법중 하나인 미세주입법은 여러 가지 어려운점과 문제점을 가지고 있으므로 이를 극복하고 보다 효율적인 유전자도입방법을 개발코자 어류 정자-DNA 결합에 의한 외래 유전자 도입방법의 개발과 그 결합능을 증대시키기 위한 electroporation의 효과에 대해 연구 하였다. 우선, 실험동물어종으로서 산업적·식량적 가치를 가지는 미꾸라지 (Misgurnus mizolepis)를 이용하여 암컷 성체체중당 hCG 10 I.U.를 복강내 주사한 후 10-13 시간 이후에 배란을 유기하였으며, 수컷의정소를 적출하여 fish Ringer'ssolution(fRS)에서 파쇄하여 정자를 추출한 후kanamycin-supplemented loachculture medium(kLCM)으로 수정을 실시하였다.정자-DNA의 결합특성을 관찰하고자, 정자표면 단백질을 high ionicstrengthbuffer(HIS)를 이용하여 추출해낸 후, SHS-PAGE를 수행한 결과 30kDa의 정자 세포막 특이적인 band를 관찰하였다. 정자와 외래 plasmid DNA에 대해 4℃에서 진탕 배양및 정치배양을 수행한 결과, 수정율 및 성장률에는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 가시적인 lacZ 또는 green fluorescent protein(gfp)의 발현은 관찰되지 않았다. 이에 정자-DNA상호간의 결합능을 증대시키기 위해서 electroporation을 실시하였다. 이때, 본 실험을 위해서 새로이 lacZ와 gfp를 reporter 유전자로 가지면서 CMV promoter에 의해서 조절되는 plasmid DNA (pJJ9)을 구축하였으며, 이를 이용하여 정자와 공배양한 후 이에electroporation으로써 전기자극을 0.03 mA 및 0.05mA로 각각 1회 및 6회 주었다. 그 결과 정자의 운동성, 수정율, 초기발생율은 대조구와 유사했으며, 전하량과 자극 횟수가 증가함에 따라서 외래 유전자의 발현강도 또한 증가하였다. 0.05 mA의 6회 조건하에서 100%의 후기배내에서 삽입 유전자인 lacZ의 가시적인 발현을 보았다. 이로부터 gDNA를 추출하여 PCR로 pJJ9에 대한 probe를 합성한 후 이를 DIG-labeling하여 Southern hybridization하여서 외래 유전자의 삽입여부를 확인하였다.위의 결과로서 gfp 및 lacZ는 미꾸라지 배세포 및 치어세포에서 정상적으로 reporter유전자로서 전사 및 복제산물을 만들어 낼 수 있으며, electroporation에 의해서 정자와DNA간의 결합이 향상됨을 보여주었다. 본 실험의 결과로부터,electroporation에 의한 정자에 의한 외래 유전자의 도입이 가능하며 이 기술을 산업적으로 이용할 경우 보다 효율적인외래 유전자 도입이 이루어질 것이다.

Abstract ▼

Numerous transgenic animals from various species have beenstudied and some beneficial transgenic products are available. Because fish species,egg numbers, and agricultural/industrial interests are various, concernings abouttransgenic fish are increasing as well as researches under

Numerous transgenic animals from various species have beenstudied and some beneficial transgenic products are available. Because fish species,egg numbers, and agricultural/industrial interests are various, concernings abouttransgenic fish are increasing as well as researches undergoing. However, amicroinjection to produce transgenic fish has a number of difficulties to peform. So, toestablish more easy and efficient transgenic method, gene transfer by sperm-DNAbinding was studied, and also to improve the binding, electroporation was introduced tosperm-DNA binding.As a model fish loach (Misgurnus mizolepis) which is commercially beneficial fishin Korea was used. To induce ovulation, intraperitoneal injection of hCG 10 I.U. pergram body weight of female loach, and after 10-13 h of the injection eggs wereobtained. Testes were isolated from male loach and mashed in fish Ringer's solution(fRS), and kanamycin-supplemented loach culture mediuem (kLCM) was addet tosperm-egg mixture for fertilization.SDS-PAGE was performed to identify the sperm surface-specific protein by highstrength buffer (HIS), and as a result, 30 kDa sperm cell membrane-specific band wasobserved Both flux and stationary incubation of sperm-DNA at 4℃ showed nosignificant differences of fertility and hatching rate as well as no expression of lacZ orgreen fluorescent protein (gfp). To improve the sperm-DNA binding, fistly, pJJ9 whichhas lacZ and gfp encoding genes under the control of CMV promoter was newlyconstructed, and subsequently pJJ9 was used during electroporation of sperm-DNAincubation at 0.03 mA and 0.05 mA with 1 or 6 cycle each. Consequently, spermmotility, fertility and developmental rate were not significantly different from those ofcontrol group, and as the current and the cycle were increased, the foreign geneexpression intensities were increased. At 0.05 mA by 6 cycle, 100% lacZ geneexpression was obtained, and also Southern hybridization which was used probe ofDIG-labeled PCR products of the region of pJJ9 showed foreign gene introduction.As a result, gfp and lacZ could be used as reporter genes in loach embryos, andelectroporation improved the sperm-plasmid DNA binding and subsequent geneexpression.

목차 Contents

• 1. 서론...7
• 1) 연구배경...7
• 2) 연구목적...10
• 3) 연구범위...12
• 2. 연구 재료 및 방법...14
• 1. 생식세포의 공급체계...14
• 2. 미꾸라지의 초기배의 인공수정...14
• 3. Reporter plasmid DNA...15
• 4. E. coli와 plasmid DNA의 회수...19
• 5. 정자-DNA...20
• 6. 유전자 발현의 검색...21
• 1차년도...24
• 3. 결 과...24
• 1) 정자회수방법의 개선...24
• 2) 정자표면 단백질...25
• 3) 정자-DNA의 공배양이 체외수정 및 초기발생에 미치는 영향...27
• 4) 정자-DNA 결합에 의한 유전자 발현의 경시적 변화...28
• 4. 고찰...31
• 2차년도...33
• 3. 결과...33
• 1) Electroporation 조건의 확립...33
• 2) 정자-DNA의 전기자극 (electroporation)에 의한 유전자 도입...34
• 3) 정자-DNA 전기자극에 의한 pJJ9 유전자의 발현양식...35
• 4) Southern hybridization에 의한 유전자 삽입의 분석...42
• 4. 고 찰...43
• 5. 인용문헌...46