초록 ▼

플라스미드 벡터 유전자치료제는 바이러스제제와 달리 인체 안전성이 확보되었으나 단독 투여시 그 전달및 발현 효율이 비교적 낮은 것이 문제이며, 이에 대한 해결 방법으로 의료기기인 전기충격기 (Electroporator, 이하 EP)를 이용한 전기충격 유전자 도입방법 등의 기술이 도입되고 있다. 본 실험에서는 HBsAg, luciferase를 발현하는 DNA 플라스미드를 구축하여 EP를 병용한 안전성 평가시 고려사항이 될 수 있는 독성시험과 개선된 유전자전달에 의한 플라스미드의 조직별 분포 및 단백질 발현지속성을 평가하였다. 독성시험의

플라스미드 벡터 유전자치료제는 바이러스제제와 달리 인체 안전성이 확보되었으나 단독 투여시 그 전달및 발현 효율이 비교적 낮은 것이 문제이며, 이에 대한 해결 방법으로 의료기기인 전기충격기 (Electroporator, 이하 EP)를 이용한 전기충격 유전자 도입방법 등의 기술이 도입되고 있다. 본 실험에서는 HBsAg, luciferase를 발현하는 DNA 플라스미드를 구축하여 EP를 병용한 안전성 평가시 고려사항이 될 수 있는 독성시험과 개선된 유전자전달에 의한 플라스미드의 조직별 분포 및 단백질 발현지속성을 평가하였다. 독성시험의 경우, 화학시험 연구소(GLP기관)에서 EP 병용투여 시 마우스에서의 용량별 단회독성과 심장독성 평가를, 원숭이에서는 10주간 회 반복투여에 따른 반복투여독성과 심장기능 평가를 수행하였고,시험결과 EP 도입 및 플라스미드 투여에 따른 독성은 나타나지 않았다. 유전자치료제 잔류 및 벡터의 생체분포 시험자료는 중요한 약리자료일 뿐 아니라 독성시험에 있어서도 의미 있게 평가되어 왔다. 개발 초기에는 유전자치료제 벡터의 분포, 발현지속 및 삽입에 관한 평가시험을 민감도가 높은 정량 PCR(Q-PCR)을 사용하여 벡터 DNA의 생체분포를 분석하였다.
EP 병용투여에 의한 개선된 플라스미드 전달 효과가 DNA 및 단백질의 체내동태 및 잔류량에 미치는 영향을 평가하기 위해 Balb/c 마우스 및 원숭이에 투여방법 및 용량을 변화시켜 투여하였다. 실험결과 Balb/c 마우스를 이용한 실험에서는 DNA 백신을 투여한 뒤 1일보다 2일째 발현된 단백질 양이 많았으며 2일 째 투여 근육부위 및 비장을 제외하고는 단백질이 분포하지 않았다. 단백질 발현은 투여 10일까지 지속되었으나 2일에 비해 많이 분해된 상태였다. 정량 PCR법을 사용한 유전자치료제 벡터의 생체분포 분석결과, 플라스미드 제제는 근육 투여 후 빠른시간 내에 정량한계 이하로(100개/1㎍ 게놈 DNA) 소실되었고 투여부위를 제외하고는 분포하지 않았다. 비장에서 검출된 단백질이 플라스미드의 분포에 의한 것이 아님을 확인하였기 때문에 혈중 HBsAg을 검출해 본결과, mg 범위를 검출하는 Western blot법으로는 확인 할 수 없었지만, 민감도가 높아 ng 단위까지 검출할 수 있는 ELISA kit으로는 EP 병용투여 후 시간별로 혈중으로 방출된 HBsAg 단백질이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉 조직에서 방출된 단백질이 혈류를 타고 비장에서 축적되어 검출된 것으로 추정할 수 있다. 위의 실험결과를 바탕으로 EP를 병용 투여하는 DNA 백신 제제의 안전성 평가를 위한 시험법 및 평가 기준을 확립할 수 있었다.

Abstract ▼

The in vivo DNA delivery of a plasmid DNA-encoding-specific gene is a promising method of gene therapy and vaccination. However, one limiting factor may be inefficient uptake of DNA by cells in situ. Electroporation is one of the widely used techniques to facilitate DNA delivery in vivo. To provide

The in vivo DNA delivery of a plasmid DNA-encoding-specific gene is a promising method of gene therapy and vaccination. However, one limiting factor may be inefficient uptake of DNA by cells in situ. Electroporation is one of the widely used techniques to facilitate DNA delivery in vivo. To provide strong scientific basis of gene therapy combined medical device, we investigated the applicability in vivo animal model and efficacy of electroporator with the plasmid DNA encoding HBsAg and luciferase. In order to provide a strong scientific base for regulatory review of gene therapy, Korea Institute of Toxicology(approved GLP) conducted acute, repeated and heart related toxicity (ECG)test in animals(rat and monkey). There were no DNA vaccine injection toxicity affected by EP combination.
Protein persistence and plasmid biodistribution study data of gene therapy products have been evaluated not only as the important pharmacolgical data but also meaningfully in the toxicity study. For biodistribution, persistence and integration studies, we performed with the real time-PCR(Q-PCR) method to detect and quantify the amount of vector DNA in vivo assay in these days, which is more sensitive and convenient. To evaluate advanced DNA vaccine delivery by EP, we tested protein persistence and biodistribution study First, to evaluate the safety of plasmid DNA vaccine, we analyzed the biodistribution/persistence of pHBsAg plasmid and protein after vaccination by the real time-PCR
, ELISA and western blot method, respectively. Bio-distribution study with Balb/c mice showed that plasmid DNA did not distribute in any tissue except the injected muscle after 2 days. But HBsAg detected at the injected muscle and thymus in all vaccinated groups. After 10 days, mice that had undergone electroporation lasted protein expression in injected muscle compared to mice having undergone IM alone. In our study, plasmid vectors were rapidly disappeared under the LOQ(100 copies/1㎍ of gDNA) after intramuscular injection. Adenovirus vectors were also eliminated within a few day after intradermal injection. To evaluate expression level of exogenous protein, we examined the reporter gene assay of luciferase, which is expressed from the pGL3 and plHBs vector in mice. As compared with biodistribution results of Q-PCR, luciferase expression of the vectors were measured more persistently in each injection site. Taken together, we showed that the Q-PCR method could be used to evaluate the biodistribution of gene therapy vector and protein expression level is different from the distribution status of the vector DNA. Taken together, we established the methods and standard protocols to evaluate pharmacokinetics and efficacy of gene therapy products using electroporator.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• I 연구개발과제 연구결과 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 6
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 7
• 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 10
• 가. 국외 ... 10
• 나. 국내 ... 13
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 14
• 1. 연구방법 ... 14
• 2. 연구결과 ... 19
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 31
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 34
• 1. 연구개발 목표 달성도 ... 34
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 36
• 제1절 활용성과 ... 36
• 제2절 활용계획 ... 37
• 제7장 참고문헌 ... 38