초록 ▼

성인형 치주염은 세균에 의한 감염질환으로 성인에 있어 치아상실을 초래하는 주원인이다. Porphyromonas ginvalis는 성인형 치주염에 가장 중요한 원인균으로 알려지고 있다. P. gingivalis의 경우는 표면구조물인 Fimbriae를 이용하여 구강조직에 부착하고 결과적으로 감염을 유발한다. Fimbriae를 구성하는 물질 중에서도fimbriae의 주골격을 이루는 fimbrillin 단백질이 P. gingivalis의 부착을 주도한다.Fimbriae가 P. gingivalis

성인형 치주염은 세균에 의한 감염질환으로 성인에 있어 치아상실을 초래하는 주원인이다. Porphyromonas ginvalis는 성인형 치주염에 가장 중요한 원인균으로 알려지고 있다. P. gingivalis의 경우는 표면구조물인 Fimbriae를 이용하여 구강조직에 부착하고 결과적으로 감염을 유발한다. Fimbriae를 구성하는 물질 중에서도fimbriae의 주골격을 이루는 fimbrillin 단백질이 P. gingivalis의 부착을 주도한다.Fimbriae가 P. gingivalis감염의 근본적인 원인이기 원인이기 때문에 fimbriae 또는fimbrillin을 이용한 vaccine이 치주조직 파괴를 예방할 수 있다는 가능성이 동물실험에서 제시되었다. 그러나 한 집단에서 혈청학적으로 다양한 종류의 P. gingivalis가 나타나기 때문에 한균주에 대한 예방 vaccine은 같은 항원성의 균주는 억제하나 다른 균주에는 효과가나타나지 않을 수 있다. 따라서 P. gingivalis fimbriae를 대상으로하여 예방 vaccine을고안할 경우 fimbriae의 항원이질성을 조사하는 것은 필수적인 단계이다. 그러나 아직까지는 여러 P. gingivalis 균주로부터 fimbrillin 단백질을 순수하게 존재하는 방법이 개발되어있지 않아 P. gingivalis fimbriae의 항원이질성에 관한 연구가 이루어지지 않고 있다. 항원이질성(혈청형)조사에는 fimbriae에 대한 항체가 필요하고, 항체생산을 위해선 순수하게정제된 fimbrillin 단백질이 준비되어야 한다. 본 연구에서는 여러 P. gingivalis균주로부터fimbrillin을 순수정제하는 간단한 방법을 개발하였고, 정제한 fimbrillin을 주사하여 면역혈청을 얻은 다음 P. gingivalis fimbriae의 항원이질성을 조사하였다.본인이 과거에 제시한 각각의 fimbriae group을 대표하는 P. gingivalis 균주2561,A7A1-28, 9-14K-1으로부터 초음파 추출물을 얻은 다음 8 M guanidine HCI로 처리하고, 6 M guanidine HCI로 평행된 Sepharose CL-6B Column에서 gel filtrationChromatography를 시행하여 fimbrillin단백질을 분리하였다. 정제한 fimbrillin 단백질은토끼에 주사하여 면역혈청을 생산하였고, Protein A-affinity column을 이용하여 IgG 항체를분리하였다. IgG 항체들을 사용하여 전자현미경하에서 immunogold localization을 시행한결과 균주들의 fimbriae 구조물에 금입자가 반응하여 부착되어 있는 것이 관찰되었다. 이들 IgG 항체를 사용한 immunoblot 분석법으로 21개 P. gingivalis 보관 균주에 대한fimbriae 항원이질성을 조사하였다. P. gingivalis 초음파 파절물을 비환원상태에서 80℃로처리하여 항원으로 사용하였다. 4번부터 6번 아미노산 배열이 Val=Gly-Asp인 fimbrillin단백질을 갖는 균주들(fimbriae group 1)은 P. gingivalis 2561의 fimbrillin에 대한 IgG 항체(anti-2561)와 강한 면역반응을 보였고 anti-A7A1-28와는 약한 반응을 나타냈다. 4번 아미노산이 Glu인 fimbriae group 2와 4번부터 6번 아미노산이 Asn-Ala-Gly 배열을 보이는fimbriae group 3에 속하는 균주들은 anti-A7A1-28와 면역반응을 보였다. 반면 일반 균주들과 크게 다른 N-말단 아미노산배열을 보이는 9-14K-1과 HG 564 균주(fimbriae group 4)는 anti-9-14K-1 하고만 반응하였다. 이들 결과는 P. gingivalis fimbriae간에 다양한 항원이질성이 존또한 거의 대부분의 균주들은 3가지 항원 group 가운데 한 group에속하는 것으로 나타났다.본 연구를 통해 얻어진 fimbrillin정제방법, 항체 및 제반 연구조건들이 확립되었기 때문에 앞으로 한국인에서 분리되는 P. gingivalis균주의 항원이질성 조사가 광범위하게 이루어질 수 있을 것이며, 이는 한국인을 위한 fimbriae vaccine 개발에 기초자료로 사용될 수있을 것이다.

Abstract ▼

Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)is the most importantcausative agent involved in adult periodontitis. Adherence of P. gingivalis to oralsurfaces is mediatedto a large extent by fimbrillin, a major structural subunit offimbriae. The possibility that immunization with fim

Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)is the most importantcausative agent involved in adult periodontitis. Adherence of P. gingivalis to oralsurfaces is mediatedto a large extent by fimbrillin, a major structural subunit offimbriae. The possibility that immunization with fimbriae (fimbrillin) protectsindividuals from periodontal tissue destruction has been demonstrated in gnotobioticrats. Since many pathogenic organisms resort to heterogeneity to subvert hostimmune responses, the heterogeneity of the fimbrillin proteins should be consideredwhen the proteins are designed to be used as anti-colonization vaccines. Purepreparation of Proteins is a prerequisite for antibody production and subsequent studyof the antigenic diversity in the fimbrillin proteins among strains of P. gingivalis. Noreported method has been successful and reproducivle in purifying fimbrillin. In thepresent study a simple and efficient purification method for purifying the fimbrillin fromvarious strains of P. gingivalis was developed and antigenic heterogeneity of fimbriaeamong P. gingivalis strains was observed.The pure fimbrillin proteins were prepared from the sonic extracts of crudefimbriae from P. gingivalis 2561, A7A1-28, EM-3, and 9-14K-1 which are representativestrains of different fimbrial groups, by repetitive gel filtration on a Sepharose CL-6Bcolumn equilibrated with 6 M guanidine HCL. Polyclonal antibodies were raisedagainst the purified fimbrillin proteins and the IgG fractions were purified by proteinA-affinity chromatography. In immunogold localization using the IgG antibodies underthe electron microscope, gold particles were found to be deposited along the fimbrialstructures on the whole cells of P. gingivalis. Antigenic heterogeneity of fimbrillinProteins among P. gingivalis strains was examined by immunoblot analysis using thelgG antibodies to the purified fimbrillin proteins and as antigens; partially dissociatedfimbriae from 21 strains of P. gingivalis. Fimbrillin proteins of strains with aminoacids Val-Gly-Asp at positions 4 to 6 reacted strongly with antibodies to strain 2561fimbrillin proteins (anti-2561) and weakly with anti-A7A1-28. Strains which belong tofimbrial groups with the amino acid residue Glu at positions 4 to 6, reacted withanti-A7A1-28. In Contrast, stains 9-14K-1 and HG 564 which have N-terminalsequences. Most of the strains belonging to the same fimbrial group, based on theN-terminal sequence of fimbrillin, appeared to be antigenically homologous; most of thestrains tested appeated to belong to one of three antigenic based on fimbrillin proteins.The procedures of fimbrillin purification and anti-fimbrillin antibody production,and the experimental conditions established through the present study will be helpful inpursuing the future antigenic heterogeneity study on fimbrillin of P. gingivalis strainsisolated from the Koreans. The obtaining results will be used as fundamentalknowledge in designing anti-colonization vaccines especially for the Koreans.

목차 Contents

• 1. 발표논문 및 발표예정논문의 본문...7
• 게재예정증명서...12
• Abstract...14
• Introduction...15
• Materials and Methods...16
• Results...19
• Discussion...20
• References...24
• 2. 연구수행관련 논문발표 목록서...32
• 3. 자체평가서...33