[논문]Porphyromonas gingivalis에 대한 오리나무 줄기 추출물의 항균활성 및 생물막 형성 억제 효과

김혜수; 조수정

doi:10.5352/jls.2019.29.12.1386

[국내논문] Porphyromonas gingivalis에 대한 오리나무 줄기 추출물의 항균활성 및 생물막 형성 억제 효과
Antibacterial and Antibiofilm Activities of Alnus japonica Stem Extract against Porphyromonas gingivalis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.12, 2019년, pp.1386 - 1392

김혜수 (경남과학기술대학교 제약공학과) , 조수정 (경남과학기술대학교 제약공학과)

초록
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본 연구에서는 천연물유래 구강건강소재로써 염료식물의 이용 가능성을 알아보기 위해 오리나무, 옻나무, 치자나무, 황칠나무, 황벽나무, 회화나무 줄기 추출물의 구강미생물에 대한 항균활성을 조사하였다. 6 종의 국내 자생 염료식물의 줄기에서 추출한 에탄올 추출물 중 오리나무 줄기 추출물(1 mg/disc)이 치주질환 원인균인 P. gingivalis KCTC5352에 대해 가장 우수한 항균활성을 나타내었다. 오리나무 줄기 추출물은 P. gingivalis KCTC5352에 대해 양성대조구로 사용한 chlorhexidine과 유사한 항균활성을 나타내었으며 P. gingivalis KCTC5352의 MIC는 0.4 mg/ml였고 MBC는 0.6 mg/ml였다. 오리나무 줄기 추출물이 0.2-2.0 mg/ml 농도로 처리된 배양액에서 P. gingivalis KCTC5352의 바이오필름 생성율과 세균 생육은 추출물의 농도가 증가할수록 저해되는 경향을 보였다. 또한 P. gingivalis KCTC5352의 superoxide dismutase (SOD)와 섬모에 대한 mRNA 발현도 추출물의 농도가 높아질수록 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하면 오리나무 줄기 추출물은 치주질환 원인균인 P. gingivalis KCTC5352에 대한 항균활성과 생물막 생성 억제능이 우수하기 때문에 천연물유래 구강건강소재로써 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the potential of dye plants as natural oral health products. The antibacterial activity of ethanol stem extracts of A. japonica, R. verniciflua Stokes, G. jasminoides, D. morbifera, P. amurense Rupr., and S. japonica against P. gingivalis KCTC 5352, S. mutans KCTC3065, S. downei KCTC3634, S. sanguinis KCTC3284, and S. gordonii KCTC 3286 was confirmed. Among the stem extracts from 6 dye plants grown in Korea, ethanol extract from A. japonica stem (1 mg/disc) showed the highest antibacterial activity against P. gingivalis KCTC5352. The A. japonica stem extracts showed antibacterial activity similar to chlorhexidine, which was used as a positive control. The MIC and MBC of P. gingivalis KCTC5352 were 0.4 mg/ml and 0.6 mg/ml, respectively. The biofilm production rate and cell growth of P. gingivalis KCTC5352 in the cultures treated with 0.2-2.0 mg/ml of A. japonica extract were significantly decreased in a concentration-dependent manner. In addition, the mRNA expression of the superoxide dismutase and fimA associated with fimbriae formation in these cultures was suppressed, also in a concentration-dependent manner. Based on these results, it is concluded that A. japonica stem extracts can be used as an oral health product derived from natural materials, as demonstrated by its antibacterial action against and inhibition of biofilm formation of P. gingivalis KCTC5352.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Antibacterial activity of ethanol extracts (1 mg/disc) from A. japonica stem against P. gingivalis KCTC5352.
표 Table 1. Oligonucleotides used for real-time PCR in this study
그림 Fig. 2. Bacterial growth and biofilm formation of P. gingivalis KCTC5352 in brain-heart infusion broth (BHIB) treated with ethanol extracts of A. japonica stem (0.2-2.0 mg/ml). Growth and biofilm formation were measured under anaerobic condition. All assays were performed in triplicate, and mean values and standard deviations are shown.
표 Table 2. Antimicrobial activities of ethanol extracts (1 mg/ml) from stem of dye plants against oral microorganisms
표 Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of ethanol extract of A. japonica stem against P. gingivalis
그림 Fig. 3. Effects of A. japonica stem extract on expression of sod and fimA genes in P. gingivalis KCTC5352 by real-time PCR analysis. The expression was normalized to gyrA gene used as a reference gene. Results are shown as the ± SD of five replicates.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 오리나무 줄기 추출물은 P. gingivalis에 대해 항균활성이 있는 천연물유래 구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단되어 오리나무 줄기 추출물을 선발하여 추가적인 실험을 수행하였다.
본 연구에서는 구강미생물인 P. gingivalis에 대한 오리나무 줄기 추출물의 항균활성과 바이오필름 생성 억제 효과를 조사하여 천연물 유래 구강 건강소재로써 오리나무 줄기 추출물의 이용 가능성을 알아보고자 한다.

제안 방법

4 mg/ml였다. P. gingivalis 의 MBC는 MIC인 0.4 mg/ml 및 그 이상의 농도에 해당하는 P. gingivalis 배양액을 고체배지에 배양하였을 때 0.6 mg/ml 및 그 이상의 농도에서 colony를 관찰할 수 없었으므로 0.6 mg/ml로 결정하였다(Table 3).
cDNA 는 superscript VILO cDNA synthesis (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 합성하였고 real-time PCR은 CFX96 touch^TMreal-timePCRdetectionsystem (Bio-Rad,USA)을 이용하여 수행하였으며 실험에 사용된 primer는 Table 1과 같다 [14, 31]. PCR 반응은 ssoadvanced^TMuniversalSYBR^Ⓡ green supermix (Bio-Rad, USA)를 사용하여 95℃에서 30초, 95℃에서 10초, 60℃에서 20초씩 35 cycle을 반복하여 수행하였다. PCR 반응 종결 후 melt-curve analysis를 수행하여 유전자 증폭의 정확성을 재확인하였으며 유전자의 상대적 발현량은 endogenous control로 사용한 P.
0 mg/ml 농도의 추출물을 처리한 다음 37℃에서 배양한 배양액을 원심분리하여 얻은 pellet으로부터 RNeasy Kit (Qiagen, Hillden, Germany)를 이용하여 분리하였다. cDNA 는 superscript VILO cDNA synthesis (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 합성하였고 real-time PCR은 CFX96 touch^TMreal-timePCRdetectionsystem (Bio-Rad,USA)을 이용하여 수행하였으며 실험에 사용된 primer는 Table 1과 같다 [14, 31]. PCR 반응은 ssoadvanced^TMuniversalSYBR^Ⓡ green supermix (Bio-Rad, USA)를 사용하여 95℃에서 30초, 95℃에서 10초, 60℃에서 20초씩 35 cycle을 반복하여 수행하였다.
5% crystal violet으로 20분 동안 염색하였다. 바이오필름 생성 억제능은 crystal violet에 염색된 바이오필름을 70% 에탄올에 용해한 후 575 nm에서 spectrophotometer (Softmax M5, Molecular Devices, USA)로 흡광도를 측정하여 확인하였다.
), 회화나무(Sophora japonica) 등의 줄기는 서울 경동시장 도매상가에서 건조된 것을 구매한 다음 분쇄하여 사용하였다. 분쇄한 오리나무, 옻나무, 치자나무, 황칠나무, 황벽나무, 회화나무 등의 줄기는 각각 80% 에탄올에 침지한 다음 상온에서 2시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출물은 Whatman filter paper (No.
1과 같다. 시판되고 있는 구강케어제품에서 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan은 각각 0.1%, 0.2%, 0.3%의 농도로 사용되고 있으며 본 실험에서는 오리나무 줄기 추출물과 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan의 항균활성을 1 mg/disc의 농도에서 비교하였다. 그 결과, 오리나무 줄기 추출물은 P.
오리나무 줄기 추출물이 P. gingivalis의 SOD에 대한 mRNA 발현에 미치는 영향은 sod 유전자를 primer로 이용한 real time-PCR로 확인하였으며 그 결과는 Fig. 3에 나타내었다. Real time-PCR을 이용하여 추출물(0.
오리나무 줄기 추출물이 P. gingivalis의 섬모에 대한 mRNA 발현에 미치는 영향은 fimA 유전자를 primer로 이용한 real time-PCR로 확인하였으며 그 결과는 Fig. 3에 나타내었다. Real time-PCR을 이용하여 추출물(0.
추출물의 구강미생물에 대한 항균활성은 agar diffusion method [6]에 따라 P. gingivalis, S. mutans, S. downei, S. sanguinis, S. gordonii가 각각 도말된 고체배지에 추출물의 농도가 1 mg/disc인 paper disc (8 mm diameter, ADVANTEC, Tokyo, Japan)를 얹어 배양한 다음 paper disc 주위에 나타난 clear zone의 크기를 측정하여 조사하였다. 양성 대조구로는 구강케어제품에 사용되고 있는 항균제인 chlorhexidine (Sigma Aldrich, St.
0 mg/ml 농도로 처리한 다음 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 구강미생물의 증식이 나타나지 않는 최소 농도를 최소성장억제 농도로 정하였다. 추출물의 최소살균농도(minimal bactericidal concentration, MBC)는 최소성장억제 농도로 확인된 추출물 농도로부터 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 다음 균수의 99.9%가 사멸된 추출물의 농도로 정하였다.
추출물이 구강미생물의 SOD와 섬모에 대한 mRNA 발현에 미치는 영향은 sod와 fimA유전자를 primer로 사용한 real-time PCR로 조사하였다. Total RNA는 37℃에서 24시간 동안 혐기 배양한 후 액체배지에 현탁한 구강미생물(O.
6). 희석된 배양액에 추출물을 0.2-2.0 mg/ml 농도로 처리한 다음 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 구강미생물의 증식이 나타나지 않는 최소 농도를 최소성장억제 농도로 정하였다. 추출물의 최소살균농도(minimal bactericidal concentration, MBC)는 최소성장억제 농도로 확인된 추출물 농도로부터 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 다음 균수의 99.

대상 데이터

mutans는 brain-heart infusion agar (BHIA; BD, Franklin Lakes, USA)에 계대한 다음 37℃에서 혐기배양하였다. S. downei, S. sanguinis, S. gordonii는 tryptic soy yeast extract medium 배지에 계대한 다음 37℃에서 혐기배양하였다.
구강미생물에 대한 국내 자생 염료식물의 항균활성을 알아보기 위해 사용된 균주는 그람음성균인 Porphyromonas gingivalis KCTC5352와 그람양성균인 Streptococcus mutans KCTC 3065, Streptococcus downei KCTC3634, Streptococcus sanguinis KCTC3284, Streptococcus gordonii KCTC3286 등으로 한국생명 공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. P.
국내 자생 염료식물인 오리나무(A. japonica), 옻나무(Rhusverniciflua Stokes), 치자나무(Gardenia jasminoides), 황칠나무 (Dendropanax morbifera), 황벽나무(Phellodendron amurense Rupr.), 회화나무(Sophora japonica) 등의 줄기는 서울 경동시장 도매상가에서 건조된 것을 구매한 다음 분쇄하여 사용하였다. 분쇄한 오리나무, 옻나무, 치자나무, 황칠나무, 황벽나무, 회화나무 등의 줄기는 각각 80% 에탄올에 침지한 다음 상온에서 2시간 동안 3회 반복 추출하였다.
gordonii가 각각 도말된 고체배지에 추출물의 농도가 1 mg/disc인 paper disc (8 mm diameter, ADVANTEC, Tokyo, Japan)를 얹어 배양한 다음 paper disc 주위에 나타난 clear zone의 크기를 측정하여 조사하였다. 양성 대조구로는 구강케어제품에 사용되고 있는 항균제인 chlorhexidine (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), sodium lauryl sulfate (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), triclosan (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) 등을 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 5회 이상 반복실험을 수행하여 얻어진 결과이며 실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan’s 다중 검정법으로 p<0.05 수준에서 통계적 유의성 검정을 실시하였다.

이론/모형

오리나무 줄기 추출물이 P. gingivalis의 생물막 형성에 미치는 영향은 Zhou 등[34]의 양적 분석방법을 이용하여 조사하였다. P.
추출물의 최소성장억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 액체 배지 희석법을 이용하여 조사하였다[14]. 구강미생물은 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 다음 배양액을 액체배지에 희석하였다(O.
추출물이 구강미생물의 바이오필름 형성에 미치는 영향은 Zhou 등[34]의 방법을 이용하여 조사하였다. 구강미생물은 고체배지에 도말하여 24시간 동안 혐기배양한 다음 액체배지에 현탁하여(O.

성능/효과

gingivalis의 생물막 형성에 미치는 영향은 Zhou 등[34]의 양적 분석방법을 이용하여 조사하였다. P. gingivalis 배양액에 추출물을 0.2-2.0 mg/ml 농도로 처리하였을 때, P. gingivalis 배양액에서 생물막 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 추출물이 0.
초과산화이온이 가지고 있는 자유라디칼 음이온은 세포 손상을 초래하기 때문에 SOD에 의해 초과산화이온이 산소와 과산화수소로 바뀜으로서 독성으로부터 세포를 방어하는 역할을 한다. P. gingivalis의 초과산화이온을 약화시키는 SOD에 대한 mRNA 발현은 0.4 mg/ml의 오리나무 줄기 추출물에 노출되었을 때 현저히 감소되었다. 이 결과는 산화물질이 축적될 때 축적된 산화물질의 독성을 중화시켜줄 수 있는 P.
PCR 반응은 ssoadvanced^TMuniversalSYBR^Ⓡ green supermix (Bio-Rad, USA)를 사용하여 95℃에서 30초, 95℃에서 10초, 60℃에서 20초씩 35 cycle을 반복하여 수행하였다. PCR 반응 종결 후 melt-curve analysis를 수행하여 유전자 증폭의 정확성을 재확인하였으며 유전자의 상대적 발현량은 endogenous control로 사용한 P. gingivalis의 housekeeping gene인 gyrA에 대한 sod와 fimA의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.
3에 나타내었다. Real time-PCR을 이용하여 추출물(0.2-2.0 mg/ml) 처리 농도에 따른 fimA 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, P. gingivalis 의 fimA 유전자는 추출물의 농도가 높아질수록 감소하는 경향을 나타내었다.
Real time-PCR을 이용하여 추출물(0.2-2.0 mg/ml) 처리 농도에 따른 sod 유전자의 발현 변화를 확인한 결과 P. gingivalis의 sod 유전자는 0.8 mg/ml 까지는 추출물의 농도가 높아질수록 감소하는 경향을 나타내었다.
국내 자생 염료식물인 오리나무, 옻나무, 치자나무, 황벽나무, 황칠나무, 회화나무 등의 줄기를 추출한 에탄올 추출물의 구강미생물에 대한 항균활성을 측정한 결과, 오리나무 줄기 추출물은 P. gingivalis와 S. sanguinis에 대해서, 옻나무 줄기 추출물은 P. gingivalis와 S. mutans, S. downei, S. sanguinis, S. gordonii에 대해서, 치자나무 줄기 추출물은 P. gingivalis에 대해서, 황벽나무와 황칠나무 줄기 추출물은 P. gingivalis와 S. sanguinis에 대해서, 회화나무 줄기 추출물은 P. gingivalis, S. downei, S. sanguinis, S. gordonii에 대해서 항균활성을 나타내었으며 이 중 오리나무 줄기 추출물의 P. gingivalis에 대한 항균활성이 가장 우수하였다(Table 2). P.
3%의 농도로 사용되고 있으며 본 실험에서는 오리나무 줄기 추출물과 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan의 항균활성을 1 mg/disc의 농도에서 비교하였다. 그 결과, 오리나무 줄기 추출물은 P. gingivalis에 대해 chlorhexidine과 유사한 항균활성을 나타내었다. 양이온성 항균 물질인 chlorhexidine 은 구강 내에 존재하는 세균들을 광범위하게 사멸시킬 수 있는 대표적인 항균제제이지만 장기간 사용 시 치아나 연조직에 착색이 유발되고 미각변화 가능성이 보고되고 있기 때문에 이를 대체할 항균제의 개발이 필요한 실정이다[11].
오리나무 줄기 추출물은 구강미생물 중 P. gingivalis에 대해 우수한 항균활성을 나타내었으며 오리나무 줄기 추출물 처리에 따른 P. gingivalis 의 MIC는 0.4 mg/ml였다. P.
, Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 완전히 제거한 다음 DMSO에 용해하여 사용하였다. 조추출물의 추출수율은 각각 약 37.5%, 30.3%, 32.1%, 27.8%, 18.9%, 22.6%였다.
추출물이 0.2-2.0 mg/ml 농도로 처리된 배양액에서 P. gingivalis의 생물막 생성율은 각각 80.9±0.09%, 65.4±0.08%, 31.2±0.06%, 27.1±0.02%, 24.8±0.01%, 25.3±0.02%로 추출물의 농도가 높아질수록 생물막 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었고 균주의 생육도 추출물의 농도 (0.2-2.0 mg/ml)가 높아질수록 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

후속연구

gingivalis에 대한 항균활성 및 생물막 생성 억제에 관한 연구에서 유제놀(eugenol)의 농도가 높아질수록 생물막 생성율 및 균주의 생육이 감소한다는 Zhang [33] 등의 보고와도 일치하는 결과이다. 따라서 오리나무 추출물은 P. gingivalis의 생육을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 생물막 생성도 억제할 수 있는 천연물유래 구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	구강 내 치면세균막에 의해 유발된 치석을 계속 방치했을 경우 나타나는 증상은?	치면세균막이 적절하게 제거되지 못하면 치면에 침착하게 되고 시간이 지나면서 치석으로 변하게 된다. 치석은 계속 방치하게 되면 치은출혈, 부종, 치조골 흡수로 인한 치아 흔들림이 발생될 수 있고 치아우식증과 치주질환의 원인이 된다[10]. 치주질환은 치아 주변 조직인 치은, 치조골, 치주인대 및 백악질에 염증이 발생하는 질환으로 치아 소실의 주요한 원인이며 동맥경화증과 같은 심혈관질환뿐만 아니라 폐혈증, 유산, 조산, 폐렴 및 당뇨병과도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다.
	치면세균막이란?	치아우식증과 치주질환은 구강 내 존재하는 세균에 의해 발병되는 세균감염성 질환이며 구강 세균은 음식물 섭취를 통해 영양분을 공급받고 세균 밀도가 높아지면 치아표면에 치면세균막(dental biofilm)이라 불리는 세균막(biofilm)을 형성하게 된다. 치면세균막은 치아 표면에 부착된 당 단백질(glycoprotein) 성분의 얇은 막에 약 700여 종 이상의 세균들이 부착하여 형성된 점착성 세균막이다[16]. 구강 내 치면세균막은 물리적으로 두꺼운 층을 형성하기 때문에 외부 물질의 침투가 어렵고, 세포 간 상호작용을 통해 유전적 변이가 일어나기 때문에 부유 세균에 비해 항균 물질에 대한 저항성이 높다[24, 25].
	구강 내 치면세균막의 특성은?	치면세균막은 치아 표면에 부착된 당 단백질(glycoprotein) 성분의 얇은 막에 약 700여 종 이상의 세균들이 부착하여 형성된 점착성 세균막이다[16]. 구강 내 치면세균막은 물리적으로 두꺼운 층을 형성하기 때문에 외부 물질의 침투가 어렵고, 세포 간 상호작용을 통해 유전적 변이가 일어나기 때문에 부유 세균에 비해 항균 물질에 대한 저항성이 높다[24, 25]. 치면세균막이 적절하게 제거되지 못하면 치면에 침착하게 되고 시간이 지나면서 치석으로 변하게 된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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