초록 ▼

제 1 세부과제 : 항 콜레스테롤 유산균 선발 및 콜레스테롤 저하 기능 탐색 1. 항 콜레스테롤 유산균을 분리하기 위한 전 단계로 MRS, M17, CATC등의 배지를 이용하여 618주의 유산균을 국외발효유와 국내 김 치 및 젖갈류로 부터 분리하였으며, 이들로부터 우유 응고력이 우수한 108주의 유산균을 분리하였다. 인공 내액에서의 내 산성 시험을 거처 66주의 내 산성 균류를 분리한 후 이들에 대한 in vitro 콜레스테롤 저하능이 1-20% 균주는 50주, 20-30% 균주는 12주, 30%이상 균주는 4주이었으며, 이들은 본

제 1 세부과제 : 항 콜레스테롤 유산균 선발 및 콜레스테롤 저하 기능 탐색 1. 항 콜레스테롤 유산균을 분리하기 위한 전 단계로 MRS, M17, CATC등의 배지를 이용하여 618주의 유산균을 국외발효유와 국내 김 치 및 젖갈류로 부터 분리하였으며, 이들로부터 우유 응고력이 우수한 108주의 유산균을 분리하였다. 인공 내액에서의 내 산성 시험을 거처 66주의 내 산성 균류를 분리한 후 이들에 대한 in vitro 콜레스테롤 저하능이 1-20% 균주는 50주, 20-30% 균주는 12주, 30%이상 균주는 4주이었으며, 이들은 본 실험 선발 균주로 하였다. 2. 본 실험의 4개 선발균주를 동정한 결과 Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis spp, Enterococcus faecium으 로 동정되었으며, 이들을 L. casei 0781 (L.C 0781), L. rhamnosus 2084 (L.r 2084), Lacto. lactis spp 204 (Lacto.l 204), E. faecium 402 (E.f 402)로 명명하였다. 3. 선발 균주의 성장배지에서의 균주 배양은 37℃에서 행하였으며, 내 산성과 내 답즙성 조사를 행한 결과, pH 2.0에서는 L.c 0781이 강 한 내 산성을 보였으며, pH3.0에서는 내 산성 비율이 각 균주간 유사 하였다. 대조 균주 (Lactobacillus acidophilus)보다는 더 강한 내 산성 을 보였다. 또한 내 담즙성은 oxgal이 각각 0.1, 0.3, 0.5% 첨가된 0.005M 인산나트륨 완충용액 (pH7.0)에서 37℃에서 1.5시간 간격으로 처리하였을 때 1.5 시간 이 후 선발 균주 중 L.r 2084가 가장 내 담즙 성이 우수하였다. 4. 선발 균주에 대한 발효유 제조 조건 (적정 온도는 배양 시간, pH, 산도, 유산균수)은 L.r 2084와 L.c 0781은 40℃에서 각각 4시간, 6시간, Lacto. 204는 37℃에서 6 시간, 그리고 E.f 402는 37℃ 및 4 ℃에서 12 시간 배양이 최적 발효유 제조 온도 및 배양 시간이었다. 대조 규주인 L.a 145는 40℃에서 8시간이었다. 5. 선발 균주에 대한 콜레스테롤 저하 기능을 초음파 파쇄에 의한 세포 저항성, TLC, G.C에 의한 조사 결과, 선발 균주에 의한 콜레스 테롤의 대사는 관찰할 수 없었으며, 단지 세포막내로 침착 또는 흡수 되어 세포막 성분 변화의 원인으로 작용하는 것으로 사료된다. 6. 선발 균주의 콜레스테롤 저하능은 L.r 2084 균주가 약 55.6%로 콜레스테롤 저하능이 가장 우수하였으며, 다음으로 L.c 0781이 약 48.9 %였다. 이 두 선발 균주는 L.a 145의 48.8% 보다 높은 콜레스테롤 저하능을 보였으나, Lacto.l 204 및 E.f 402는 각각 46.9%, 48.3%로 대조 균주 보다 다소 낮은 콜레스테롤 저하능을 보였다. 제 2 세부과제 : 항 콜레스테롤 유산균 개발을 위한 형질 전환 및 vector system 개발 1. 유산균의 원형질체 형성 및 재생을 위하여 37℃에서 60분간 Lysozyme과 mutanolysin을 동시에 처리하였을 때 99.9% 이상의 나출 율을 보였고, 또한, 배양 초기에 최종농도 0.1%의 glucose가 첨가된 배지에서 시험 균주를 배양하였을 때 0.5%에서 보다 높은 재생율을 보였다. L.c 0781, L.r 2084 그리고 Streptococcus thermophilus 2590 (S.t 2590) 균주는 LCM-R 재생 배지에서, 그리고, Streptococcus thermophilus 13101 (S.t 13101) 균주는 TCM-R 재생배지에서 가장 높은 재생 빈도를 보였다. 2. 각 균주의 항생제 내성을 선발 marker로 이용하여 lysozyme과 mutanolysin을 동시에 처리하여 원형질체를 형성한 후 PEG를 매개로 세포 융합을 시도하여 22 개체의 융합 균주를 선발한 후 융합체의것으로 나타났다. 3. Bio-Rad의 Gene Pulser System을 이용하여, L.c 0781과 L.r 2084 균주에 pKH80 plasmid DNA를 electrotransformation한 결과, 두 균주 모두 4.5kV/cm의 field strength에서 가장 높은 형질 전환의 효 율을 보였다. L.c 0781 균주보다 L.r 2084균주의 pulse 후의 균주 생 존율이 높았으며, field strength가 증가할수록 균주 생존율 및 형질 전환율은 감소하였다. 4. Field strength를 4.5kV/cm로 조정한 후 parallel resistor를 조정 하며 electroporation을 시도하였을 때, parallel resistor에 따른 time constant가 증가할수록 균주 생존율 및 형질 전환 효율은 감소하였다. 따라서 field strength를 4.5kV/cm이며, time constant가 4.7 일 때 가 장 높은 형질 전환 효율을 나타내었다. 5. Field strength가 4.5kV/cm, discharge capacitor를 25uF, 그리고 parallel resistor를 200Ω으로 조정한 후 cold-deionized water를 electroporation buffer로 사용하여 형질 전환을 시도하였을 때, 다른 buffer 보다 L.c 0781, L.r 2084 두 균주 모두에서 가장 높은 형질 전 환 효율을 보였고 이때의 time constant는 4.5 ms 이었다. 6. 그램 positive 균인 유산균에 가장 적절한 vector 개발을 위하여 형질 전환체의 선발에 필요한 marker와 유산균 내에서의 발현을 고려 하여 여러 종류의 vector를 electroporation에 의한 방법으로 형질전환 을 시도하던 중 연구가 종료되었고. 항 콜레스테롤 관련 유전자의 cloning은 콜레스테롤 대사 및 assimilation, degradation 관련 유전자 를 탐색하던 중 2년차 연구로 종료됨에 따라 소기의 목적을 달성하 지 못하였다. 제 3 세부과제 : 항 콜레스테롤 발효유 제조 및 in vivo 실험을 통한 혈중 콜레스테롤 저하기능 연구 1. 선발 균주 중에서 가장 좋은 starter를 선발하기 위하여 선발 균 주의 활력 시험, pH 및 적정 산도, 커드 형성 및 유청 분리 조사를 한 결과 선발 균주 중에서 L.r 2084가 starter로서 가장 우수한 기능을 나 타내었다. 2. 발효유 원료 배합률 작성은 신선유를 81%로 하고 각종 당과 청 포도 농축액을 첨가하여 향 성분을 강화하였으며, 기능성 물질로는 혈 당 저하 및 콜레스테롤 기능이 있다고 알려진 silk powder를 첨가하 였고 당도는 Brix 16%가 되도록 하였다. 3. 발효유의 대량 생산 조건 확립을 위한 예비 실험으로 실험실 내 에서 여러 차례의 발효유 제조시험을 통하여 실험실내 발효유 제조공 정을 확립하였고, 선발 균주를 stater로 사용하여 발효유로 제조하면서 대량 생산하여 상품화하기 위한 생산 기기 조건 및 대량 제조 공정의 plant를 확립하였다. 4. 발효유의 관능검사는 panel 20명을 선정하여 2점 기호 선택시험 (paired comparison & preference test)을 사용하였으며, 질문지를 만 들어 선택비율에 대한 t-검정으로 유의성을 조사하였다. 대조구는 현 재 항 콜레스테롤 발효유 제품의 starter로 사용하고 있는 L.a 145로 제조한 발효유를 사용하였고 t-value를 가지고 평가할 때 L.r 2084 starter로 제조한 발효만이 5%수준의 유의성을 나타내었을 뿐 기타 시료간에는 유의성이 없었다. 대부분의 panel들에 대한 기호선택 이유 는 풍미가 신선하고 후미가 좋은 것이었으며 균주별로는 L.r 2084로 제조한 발효유의 관능평가가 가장 좋은 것으로 나타났다. 5. 발효유를 급여하지 않은 구를 대조구로 하고 급여한 구를 실험구 로 배치하여 2 주 간격으로 혈액을 채취한 후 Total cholesterol, LDL-C, HDL-C의 함량을 측정한 결과, 6 주 후부터 대조구와 실험구 사이에 5%의 유의성이 있었으며 10주차에는 1%수준의 유의성이 있었 다. 그러나 HDL-C의 경우는 유의성이 없었다. 이상의 결과를 종합하 여볼 때 선발 균주로 제조한 발효유를 실험동물 (토끼)에 투여할 경우 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 있음을 확인하였다. 6. 본 실험에 사용한 토끼를 대상으로 대동맥과 관상동맥의 실질 장 기를 채취, 포르말린으로 고정한 후 표본을 제조하여 대동맥 및 관상 동맥에 대한 병리 조직학적 검사를 수행하였던 바 발효유를 급여하지 않은 군에서는 대동맥, 관상동맥에서 동맥경화증의 소견이 뚜렷이 관 찰되었으며, 이와는 대조적으로 발효유를 급여한 군에서는 이러한 병 변이 경미하게 관찰되었거나 전혀 관찰되지 않았으며 특히 L.r 2084로 제조한 발효유를 급여한 군이 가장 병변이 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험에 사용한 선발 유산균들이 동맥경화증의 예방 및 치료에 상 당히 효과가 있음을 병리 조직학적으로 확인하였다.

Abstract ▼

First subject : Selection of Anticholesterolemic Lactic Acid Bacteria and Detection of Cholesterol Lowering Function 1. As the prestep to separate anticholesterolemic lactic acid bacteria using MRS, M17 and CATC media, 618 strains of lactic acid bacteria were separated from foreign fermented milk, K

First subject : Selection of Anticholesterolemic Lactic Acid Bacteria and Detection of Cholesterol Lowering Function 1. As the prestep to separate anticholesterolemic lactic acid bacteria using MRS, M17 and CATC media, 618 strains of lactic acid bacteria were separated from foreign fermented milk, Kimchi and pickled fish products. After that, 108 strains of lactic acid bacteria which had milk clotting ability were separated. Among them, the ability of lowing cholesterol by 1∼20% were 50 strains, by 20∼30% were 12 strains, by over 30% were 4 strains. In this study, 4 strains that are able to lower over 30% were used as experimental strains. 2. Four strains of lactic acid bacteria which had cholesterol lowering effect over 30% were identified with Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis spp., and Enterococcus faecium. they were noted as Lactobacillus rhamnosus 2084(L.r 2084), Lactobacillus casei 0781(L.C 0781), Lactococcus lactis spp. 204(L.l 204) and E. faecium 402(E.f 402), respectively. 3. The selected bacteria were incubated in each growth media at 37℃. L.c 0781 was the most tolerant against acid in its media adjusted to pH 2.0, but not significantly different in the tolerance against acid at pH 3.0. The tolerance of the selected bacteria against acid were higher than that of control(Lactobacillus acidophilus 145). When the selected bacteria were treated with 0.005M sodium phosphate containing 0.1%, 0.3%, and 0.5% oxgal at 37℃ for 1.5 hours intervals, L.r 2084 was the most tolerance against bile acid. 4. L.c 0781, L.r 2084, Lacto.l 204, and E.f 402 were incubated for 6 hours at 40℃, 4 hours at 40℃, 6 hours at 37℃, and 12 hours at 37℃ and 40℃, respectively, for the optimum conditions of fermented milk related to incubation time, pH, titratable acidity value, and lactic acid bacterial counts. The strain of L.a 145 as a control was incubated for 8 hours at 40℃. 5. It was considered that the function of lowering of cholesterol level by the selected lactic acid bacteria was not caused by metabolism, only due to the adsorption on cell membranes of the bacteria as a results of analysis by ultra sonication, TLC, and G. C. 6. Among the four selected strains, L.r 2084 strain had the best ability of lowering cholesterol level, the value were about 55.6%. The next strain was L.c 0781, about 48.9%. Ability of lowering cholesterol level of those two strains were higher than that of L.a 145. That of Lacto.l 204, and E.f 402 were lower than L.a 145 and the value of those strain were 46.9%, 48.3%, respectively. Second subject : Transformation and Development of Vector System for Anticholesterolemic Lactic Acid Bacteria. 1. When the selected lactic acid bacteria were treated with lysozyme and mutanolysin for the protoplast formation and regeneration for 60 min at 37℃, the protoplast forming yield were 99.9%. Furthermore, the regeneration yield of protoplast of the selected lactic acid bacteria grown in growth media containing 0.1% glucose were higher than that of 0.5% glucose. The regeneration frequency of L.c 0781, L.r 2084, and Streptococcus thermophilus 2590 (S.t 2590) was the highest on LCM-R regeneration medium and Streptococcus thermophilus 13101 (S.t 13101) was the highest in TCM-R regeneration medium. 2. Twenty two fusants were selected after induction of protoplast fusion by using selection marker against antibiotics. Stability of fusants rapidly decreased during successive cultivation from 4 to 10 times. 3. The optimum condition of transformation for L.c 0781 and L.r 2084 treated with pKH80 plasmid DNA using Gene Pulser System (Bio-Rad) was 4.5kV/cm of field strength and 4.7ms of time constant. The viability yield of L.r 2084 was higher than that of L.c 0781 after pulse, which was lower viability and transformation yield at higher field strength. 4. The optimum electrotransformation buffer of both L.c 0781 and L.r 2084 was cold-deionized buffer and that of time constant was 4.5ms when field strength, discharge capacitor, and parallel resistor were adjusted to 4.5kV/cm, 25㎌e this study did not last continuously by the third year. So, gene cloning for developing cholesterol-lowering bacteria was unsuccessful because this work was not continued after the second year. Third subject : Production of Anticholesterolemic Fermented Milk and Studies on its Effect on lowering Blood Cholesterol Level through in vivo Experiment. 1. Results showed that a starter cultures form L.r 2084 was the most effective for making fermented milk through in evaluation of activity, pH and acid values, curd formation and whey separation. 2. For preparation of fermented milk, the mixture of raw materials was 81% of fresh milk fortified with various sugar and concentrations of grapes with flavor materials. Additionally, silk powder was fortified which has known as a cholesterol-lowering substance and Brix was adjust to 16%. 3. A preliminary work was periodically performed to commercial production of fermented milk and a scheme of flow chart was established by developing a new commercial processing procedures under optimum conditions for making fermented milk. 4. Sensory evaluations of fermented milk were performed with 20 members of trained panel, Students't test being used for sensory evaluation analysis. Starter cultures from L.a 145 was used as control in fermented milk. Sensory scores noted that fermented milk added with starter cultures from L.r 2084 showed a significant difference (p<0.05) between other strains. Results showed that fermented milk treated with starter cultures from L.r 2084 was "more preferable" category for flavor and odor. 5. Total cholesterol, LDL-C, and HDL-C in rabbits fed with fermented milk showed significant differences at p<0.05 compared to the controls after 6 weeks, and significant differences at p<0.01 between treatments and control after 10 weeks. Results showed that fermented milk could be an effective dietary foodstuff for lowering the levels of cholesterol in rabbit. 6. Decrease in the amount of atherosclerosis was found in fermented milk fed rabbits, which was conformed by analysis. Specimens of arteria fixed with 40% formaldehyde. When rabbits fed with fermented milk including starter cultures from L.r 2084 was the most effective for decrease of atherosclerosis. Based on these results, the selected lactic acid bacteria in this study could be used for prevention and decrease of atherosclerosis.

목차 Contents

• 제1장 서론...26
• 제2장 항 콜레스테롤 유산균 선발 및 콜레스테롤 저하 기능 탐색...36
• 제3장 항 콜레스테롤 유산균 개발을 위한 형질전환 및 vector system 개발...111
• 제4장 항 콜레스테롤 발효유 제조 및 in vivo 실험을 통한 혈중 콜레스테롤 저하 기능 연구...148