초록 ▼

자가면역성 당뇨병의 자가 항원으로 알려져 있는 GAD, IA-2 단백질 그리고 endogenous retrovirus의 아미노산서열에 대하여 hydropathicity, acrophilicity, antigenicity 및 flexibility 등의 특성을 조사하여 항원결정기가 될 수 있는 peptide 부위를 합성, 정제하였다. Peptide항원의 항원성 검정을 위한 enzyme immunoassay(EIA)조건을 최적화하고, 최적화된 EIA조건으로 합성한 peptide에 대해 항원성 검정을 수행하였다. Mouse monoclon

자가면역성 당뇨병의 자가 항원으로 알려져 있는 GAD, IA-2 단백질 그리고 endogenous retrovirus의 아미노산서열에 대하여 hydropathicity, acrophilicity, antigenicity 및 flexibility 등의 특성을 조사하여 항원결정기가 될 수 있는 peptide 부위를 합성, 정제하였다. Peptide항원의 항원성 검정을 위한 enzyme immunoassay(EIA)조건을 최적화하고, 최적화된 EIA조건으로 합성한 peptide에 대해 항원성 검정을 수행하였다. Mouse monoclonal anti-human IgG-HRP를 periodate 및 two-step glutaradehyde 방법으로 제조하여 sorbitol용액에 희석한 후 약 40주 동안 활성이 유지되는지 실험하였다. Human pancreas cDNA library (Clontech, 미국)를 이용하여 PCR방법으로 증폭된 GAD 및 IA-2 유전자를 TA cloning한 후 염기 서열을 조사하여 확인하였다. 자가면역성 진단 EIA kit에 사용할 유전자 재조합 GAD 및 IA-2 항원을 발현시키기 위하여 GAD 및 IA-2 유전자를 C-terminal 6xHis tagged baculovirus vector에 cloning 하였다. GAD 또는 IA-2 유전자를 포함한 baculovirus vector를 곤충세포 Sf9 cell에 감염시켜 유전자 재조합 GAD 또는 IA-2 항원을 발현시켰다. 배양된 감염세포는 lysis buffer를 이용하여 lysis 시킨 후 원심분리 하여 상징액을 Ni-agarose resin(Qiagen)을 이용하여 affinity chromatography 방법으로 정제하였다. 이때 여러 가지 column loading buffer를 사용하여 침전 생성 여부와 수득률로 최적 정제조건을 결정했다. Reference panel로 사용한 혈청은 삼성의료원과 Calgary대학으로부터 제공받은 혈청으로 임상적 소견에 의해 자가면역성 당뇨환자의 혈청과 정상 혈청으로 구분하였고 시판 중인 radioimmunoprecipitation(RIP) kit를 이용해 항GAD 및 항IA-2 자가 항체를 측정하였다. Biotinylation된 유전자 재조합 GAD 및 IA-2를 이용하여 최적의 EIA 조건을 확립하고 최적화된 EIA system에서 streptavidin plate, 항원, 검체희석액의 stability를 조사하였으며 확보한 reference panel에 대한 검체실험을 수행하여 양성검체에 대한 민감도와 음성검체에 대한 특이도를 조사하였다.

Abstract ▼

The epitopes in glutamic acid decarboxylase(GAD), islet-cell antigen(IA-2) and endogenous retroviral sequences, which were identified as autoantigens that are recognized by immunoglobulins from type-1 diabetes (insulin dependent dabetes, IDDM), were predicted by combined analyses of hydropathicity,

The epitopes in glutamic acid decarboxylase(GAD), islet-cell antigen(IA-2) and endogenous retroviral sequences, which were identified as autoantigens that are recognized by immunoglobulins from type-1 diabetes (insulin dependent dabetes, IDDM), were predicted by combined analyses of hydropathicity, acrophilicity, antigenicity and flexibility parameters. Peptides corresponding to the selected regions were synthesized and purified. To determine the antigenecity of peptides, enzyme immunoassay (EIA) conditions was optimized and fifty-two peptides (10 corresponding to the GAD, 21 corresponding to the IA-2 and 21 corresponding to the endogenous retrovirus) were tested for their reactivities against type-1 diabetes patient sera. Mouse monoclonal anti-human IgG-HRP was produced using periodate or two-step glutaraldehyde method and monitored stability in sorbitol solution for 40 weeks. Using human pancreas cDNA library (Clontech, USA), GAD or IA-2 gene amplified by PCR was cloned. The cDNA of GAD or IA-2 was subcloned in C-terminal 6xHis tagged baculovirus vector and then recombinant GAD or IA-2 was expressed in Sf9 cells. Cells were harvested, centrifuged and extracted by lysis buffer. Cell lysate was applied to Ni-agarose resin(Qiagen, USA) and purified by affinity chromatography. Using buffer with different composition, purification procedure without aggregation was determined. Autoimmune diabetes patient sera were obtained from Samsung Medical Center and Medical school. University of Calgary. Sera were analyzed by anti-GAD and ani-IA-2 autoantibodies testing RIP kit. The condition of EIA using recombinant GAD and IA-2 protein was optimized. In this condition, stability of streptavidin plate, antigens and sample diluents was analyzed and reference panel sera were assayed to examine sensitivity against patient sera and specificity against normal sera.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• Projet Summery ...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...13
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...18
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...21
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...23
• 6. 첨부서류...23
• 제1세부연구개발과제 연구결과...26
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...27
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...28
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...32
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...47
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...48
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...49
• 7. 참고문헌...50
• 제2세부연구개발과제 연구결과...51
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...52
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...53
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...55
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결과...60
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...61
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...62
• 7. 참고문헌...63