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Ⅰ. 제 목 고온성 절대공생미생물의 신규 아미노산 생합성 효소를 이용한 유용 아미노산의 생물전환기술 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 본 연구과제의 연구개발 최종목표인 신규 고온성미생물 Bacillus sp. SK-1과 절대공생관계에 있는 신규 고온성 절대공생미생물 Symbiobacterium toebii SC-1 균주가 보유하고있는 독특한 방향족 아미노산 생합성효소인 tyrosine phenol-lyase (TPL) 및 tryptophan indole-lyase (TNA)와 미생물세포벽 펩티도글리칸의 주요 구성성

Ⅰ. 제 목 고온성 절대공생미생물의 신규 아미노산 생합성 효소를 이용한 유용 아미노산의 생물전환기술 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 본 연구과제의 연구개발 최종목표인 신규 고온성미생물 Bacillus sp. SK-1과 절대공생관계에 있는 신규 고온성 절대공생미생물 Symbiobacterium toebii SC-1 균주가 보유하고있는 독특한 방향족 아미노산 생합성효소인 tyrosine phenol-lyase (TPL) 및 tryptophan indole-lyase (TNA)와 미생물세포벽 펩티도글리칸의 주요 구성성분인 D-아미노산 생합성효소 D-amino acid aminotransferase (D-AAT), glutamte racemase (GluRa)의 효소 특성연구와 유전자조작을 통한 대량생산연구를 수행하여 고부가가치 유용 아미노산의 생산을 위한 생물전환 기반·응용기술 연구를 달성하고자 다음과 같은 연구를 수행하였다. 신규 고온성 절대공생미생물 SC-1이 보유한 독특한 방향족 아미노산 생합성효소 tyrosine phenol-lyase (TPL) 및 tryptophan indole-lyase (TNA)를 생물촉매로 이용한 방향족 아미노산 생산 생물전환기술 연구 신규 고온성 절대공생미생물 SC-1과 공생균주인 Bacillus sp. SK-1이 보유하고 있는 세포벽 펩티도글리칸의 주요 구성성분인 D-아미노산 생합성효소인 D-amino acid aminotransferase (D-AAT), glutamate racemase (GluRa), alanine racemase (AlaRa)의 특성연구, 유전자 조작에 의한 효소의 대량생산 및 D-아미노산 생산 생물전환기술 기반연구 Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1. 고부가가치 유용 아미노산 생산 생물전환기술 확립을 위한 재조합 생물촉매의 대량생산 재조합 생물촉매의 대량 생산을 위한 재조합 대장균의 고농도 배양 방향족 아미노산 생산효소의 대량생산을 위해 각종 유도인자와 배지성분 및 배양조건을 달리하여 최적 생산조건 연구 2. 고온성 절대공생미생물 유래의 방향족 아미노산 생합성효소를 이용한 방향족 아미노산 및 관련 유도체 생산 Tryptophan indole-lyase (TNA)를 이용한 L-tryptophan 생산 생물전환반응 연구 Tryptophan생산 생물전환 반응의 최적 반응조건 연구 3. D-아미노산 생합성 효소 신규 내열성 D-AAT 및 GluRa를 도입한 D-아미노산 생산 복합 생물전환기술의 개량 및 개선 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 D-amino acid aminotransferase (D-AAT)를 저가의 기질인 D,L-aspartate로부터 D-alanine과 L-aspartate를 생산하는 생물전환반응의 생물촉매로 도입하기 위한 기반연구 절대공생 고온성미생물의 생육지지활성을 나타내는 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 D-AAT의 생화학적 특성연구 Bacillus sp. SK-1 유래 D-AAT의 gene cloning 및 대량생산 신규 내열성 SK-1 D-AAT의 아미노산 배열분석을 통한 유사 효소간 homology 및 분자진화론적 특성연구 내열성 SK-1 D-AAT를 생물촉매로 사용하여 저가의 기질인 D,L-aspartate로부터 D-alanine과 L-aspartate를 생산하는 생물전환반응의 산업적 추진을 검토 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 glutamate racemase (GluRa)를 고부가가치 방향족 D-아미노산 생산 복합 생물촉매계의 내열성을 증가시키기 위한 생물촉매로 도입하기 위한 기반연구 (일본 교토대학 화학연구소와 국제공동연구) 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 GluRa의 특성연구 및 상온균 유래 GluRa와 효소특성 비교 (일본 교토대학 화학연구소와 국제공동연구) Bacillus sp. SK-1 유래 GluRa의 gene cloning 및 대량생산 신규 내여 고부가가치 방향족 D-아미노산 생산 복합 생물촉매계의 안정성을 개선하고 복합 생물촉매 전환반응의 산업적 이용기술을 검토 4. 신규 절대 공생미생물 유래의 신규 D-아미노산 생합성효소의 탐색 및 유전자조작 Genetic complementation 과 universal primer를 이용한 절대공생미생물의 D-AAT 및 GluRa의 탐색 (일본 교토대학 화학연구소와 국제공동연구) Genetic complementation방법에 의한 D-AAT와 GluRa탐색연구 수행 미생물유래 GluRa universal primer제조 및 Symbiobacterium toebii SC-1유래의 GluRa gene탐색연구 수행 Universal primer를 이용한 절대공생미생물의 AlaRa의 탐색 미생물유래 AlaRa universal primer제조 및 Symbiobacterium toebii SC-1유래의 AlaRa gene탐색연구 수행 5. 신규 절대공생미생물의 순수분리 및 단독배양과 계통학적 분류연구의 수행 절대공생미생물의 순수분리 및 배양특성연구 및 계통학적 분류의 수행 혼합배양액을 이용한 절대공생미생물의 순수분리 단독배양 방법 및 배양 특성 16S rRNA 및 chemotaxonomy를 이용한 계통분류학적 연구 절대공생미생물 공생인자의 탐색· 분리 및 특성연구 첨단 HPLC, FPLC법 및 절대공생미생물 순수배양법을 이용한 bioassay법으로 공생인자의 탐색 Ⅳ. 연구개발결과 1. 고부가가치 유용 아미노산 생산 생물전환 기술 확립을 위한 재조합 생물촉매의 대량생산 D-Lactose를 이용한 TPL유전자의 발현 유도 - IPTG 대체할 수 있는 유도물질로 D-lactose를 선택하여 조사한 결과 TPL의 효소활성은 각각 0.56과 0.64 units/ml을 나타났으며, SDS-PAG결과 전체 단백질의 약 30%정도로 대량 생산됨. TPL의 대량생산 - 균주 : E.coli BL21, C600, HB101 그리고 XL1-Blue를 TPL함유 재조합 plasmid로 형질전환시키고 D-lactose가 첨가된 LB에서 배양한 결과, BL21과 HB101에서 생산성이 높게 나타났음. - 탄소원의 영향 : 탄소원의 영향을 실험한 결과 glycerol을 10g/l 첨가한 경우 1.359 units/ml로 가장 높은 TPL효소생산을 나타냄. - 유도기의 영향 : Induction시간대 별로 TPL유도를 조사한 결과, 배양초기, 중기, 말기에 각 각 1.359, 1320 그리고 1.010 units/ml으로 나타났으며 배양초기에 유도하는 경우 가장 높은 효소활성을 나타냄. - D-Lactose농도의 영향 : Glycerol을 10 g/l되게 첨가한 LB배지에 D-lactose를 농도별(0∼30 g/ l)로실험하여 20 g/l에서 TPL의 효소활성이 가장 높고 그이상의 농도에서는 TPL의 효소생산이 저해됨. 회분식 배양을 통한 방향족 아미노산 생합성효소인 내열성 TPL의 대량생산 - TPL의 대량생산을 위해 재조합 E.coli BL21을 glycerol 50 g/l과 D-lactose 20g/l가 함유된 복합배지를 사용하여 2.5 L의 발효기에서 37℃ 24시간 배양후 O.D. 90 의 균체성장과 7.53 units/ml의 TPL 효소생산을 확인. 2. 공생미생물 유래의 방향족 아미노산 합성효소를 생물촉매로 이용한 Tryptophan 생산생물전환 반응의 최적 반응조건 연구 온도 : TNA는 65℃에서 가장 높은 활성을 나타내지만 실제 반응을 위한 최적온도는 37℃였으며, 이러한 현상은 반응에 필요한 기질들과 반응계를 안정화시키기 위해 포함되어진 여러 화합물들의 온도에 대한 안정성이 원인. pH : 내열성 TNA는 pH 9.0에서 가장 높은 L-tryptophan 분해활성을 나타내었으나, 실제 L-tryptophan 생산 반응 적용시 pH 8.5에서 가장 높은 생산성을 나타냄을 확인되었으나 고농도의 L-tryptophan생산시 높은 pH에서의 부반응물 생성을 막기위해 낮은 pH 8.5에서 tryptophan 생산 반응을 수행. 최적기질 농도 : indole은 약 5mM, pyruvate는 약 200 mM, 그리고 ammonia의 경우 약 1.5M에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 이 조건을 L-tryptophan 생산 반응에 적용. 반응첨가물 영향 : 조사되어진 여러 가지 반응 첨가물 중 Tween 20을 약 반응액의 2.5%정도 첨가하였을 때 가장 높은 반응성 향상. 내열성 TNA를 이용한 L-tryptophan의 대량생산 : 최적화된 생물전환 반응 조건하에서 115 g/L의 L-tryptophan 생산. 3. D-아미노산 생합성 효소 신규 내열성 D-AAT를 도입한 D-아미노산 생산 복합 생물전환기술의 개량 및 개선 가. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 D-AAT의 효소 특성연구 Bacillus sp. SK-1 유래의 D-AAT를 순수정제하고 안정성을 조사한 결과 60℃ 이상의 온도에서도 안정한 내열성 효소임을 확인. 최적 반응온도는 60℃, 최적 pH는 8.5로 결정됨. 최적 반응조건에서 SK-1 D-AAT는 bulky R-group을 갖는 아미노산 (D-norvaline, D-methionine, D-phenylalanine 등)에 대한 효소활성이 상온균인 B. spaericus 유래의 D-AAT에 비하여 현저하게 낮아서 고온성 미생물인 Bacillus sp. YM-1과 매우 유사한 기질특이성을 나타내었음. 나. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래 D-AAT의 gene cloning 및 대량생산 Bacillus sp. SK-1의 염색체 DNA로부터 D-glutamate auxotroph을 이용한 complementation실험으로 유전자 단편의 탐색 수행. D-Glutamate auxotroph인 E. coli WM335는 D-glutamate가 첨가되지 않은 배지에서 생육할 수 없는 돌연변이 균주이므로 SK-1유래의 D-AAT 유전자를 보유한 E. coli WM335 만이 생육 가능하게 됨. 이러한 선별과정을 통하여 재조합 E. coli 1종을 선별하여 3.6 kb 크기의 삽입DNA를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리하여 pDSK2로 명명함. 재조합 유전자조작에 의해 D-AAT는 재조합 대장균에서 전체 단백질 중 60%이상의 매우 높은 수준으로 과발현되어 유용 D-마미노산 생산 생물전환기술에 매우 유효하게 사용될 수 있다고 판단. 다. Bacillus SK-1유래 신규 내열성 D-AAT의 아미노산 배열분석을 통한 유사 효소간 상동성 및 분자 진화론적 특성연구 고온성 Bacillus sp. SK-1 의 D-AAT와 기존에 발표된 D-AAT들(B. subtilis, B. spaericus, B. licheniformis, Bacillus sp. YM-1 등)과의 상동성을 조사한 결과 40∼67%로 비교적 높은 상동성를 가지고 있음을 확인. D-AAT 유전자들 간의 상동성을 분자진화론적 관점에서 계통분석을 수행한 결과 Bacillus sp. SK-1 D-AAT는 기존의 Bacillus 유래 효소들과 다른 특성을 나타내며 고온성 Bacillus group에 속하는 신규 D-AAT인 것으로 판단됨. 라. Bacillus SK-1 유래의 내열성 D-AAT를 생물촉매로 사용하여 저가의 기질인 D, L-aspartate로부터 D-alanine과 L-aspartate를 생산하는 생물전환반응의 산업적 추진을 검토 Strecker's method 등의 화학합성법에 의하여 간편하게 제조할 수 있는 저가의 아미노산인 D, L-aspartate를 기질로 사용하여 Aspartam, Alitame 등의 펩타이드 감미료 원료로 널리 사용되는 L-aspartate, D-alanine을 생산하는 생물전환 반응에 Bacillus sp. SK-1 유래 내열성 D-AAT를 생물촉매로 도입하였음. 이 생물전환공정의 산업적 추진을 검토중임. (일본 교토대학 화학연구소와 국제공동연구) 4. D-아미노산 생합성 효소 신규 내열성 GluRa를 도입한 D-아미노산 생산 복합 생물전환기술의 개량 및 개선 가. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 GluRa의 효소 특성연구 Bacillus sp. SK-1 유래의 재조합 내열성 GluRa를 순수 정제하여 효소특성을 조사한 결과 최적 반응온도는 70℃, 최적 pH는 8.5로 결정됨. 앞서 결정된 최적 반응조건에서 여러 종류의 아미노산에 대한 GluRa의 기질특이성을 조사한 결과 이 효소는 glutamate에 대해서만 특이적인 활성을 나타내는 기질특이성이 매우 높은 효소로 판단됨. 나 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래 내열성 GluRa의 유전자 조작 및 대량생산 Bacillus sp. SK-1의 총염색체 DNA로부터 D-glutamate auxotroph인 E. coli WM335의 glutamate 요구성을 complemetation하는 유전자 단편의 탐색을 수행함. 재조합 E. coli WM335를 이용한 선별과정을 통하여 재조합 E. coli 1종을 선별함. 내열성 GluRa 유전자를 보유한 재조합 플라스미드를 분리하여 pGSK231로 명명함. 재조합 유전자조작에 의해 재조합 대장균에서 대량 생산을 수행함. 다. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 내열성 GluRa의 아미노산 배열분석 및 유사 효소간 상동성 고온성 Bacillus sp. SK-1 의 GluRa와 기존에 발표된 비 내열성 GluRa들(B. subtilis, B. spaericus, B. licheniformis, Bacillus sp. YM-1 B. subtilis, B. spaericus, B. pumilis)과 아미노산 배열의 상동성을 조사한 결과 51∼61%로 매우 높은 수준의 상동성를 가지고 있음을 확인함. 기존에 발표된 비 내열성 E. coli GluRa와 상동성을 조사한 결과 32%의 homology를 보였으며, 활성부위의 아미노산 cysteine잔기가 잘 보존되어 있었음. 라. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 내열성 GluRa를 생물촉매로 도입하여 고부가가치 방향족 D-아미노산 생산 복합 생물 촉매계의 안정성을 개선하고 복합 생물촉매 전환반응의 산업적 이용기술을 검토 의약용 방향족 D-아미노산의 효율적인 대량생산를 위한 복합생물촉매 전환공정에 사용되는 효소의 하나인 E. coli 유래 GluRa는 생물전환반응조건에서의 안정성이 낮으므로 반응생산성을 현저하게 감소시킴. 따라서 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 내열성 GluRa를 방향족 D-아미노산 생산 복합생물촉매 전환공정에 생물촉매로 도입하였음. 이 생물전환공정의 산업적 추진을 검토중임 (일본 교토대학 화학연구소와 국제공동연구). 5. 신규 절대 공생미생물 유래의 신규 D-아미노산 생합성 효소의 탐색 및 유전자 조작 가. Genetic complementation법에 의한 Symbiobacterium toebii SC-1의 세포벽구성 D-아미노산 생합성 효소의 탐색 GluRa 유전자가 결손되어있는 E. coli WM335를 host cell로 사용하여 genetic complementation방법에 의해 절대공생미생물 Symbiobacterium toebii SC-1유래의 D-glutamate합성 유전자의 탐색 약 4만개의 transformant중에서 35개의 D-glutamate합성 활성을 갖는 clone을 선별하여 Bacillus sp. SK-1유래의 D-AAT 와 GluRa임을 확인 나. 절대공생미생물 SC-1유래 AlaRa의 탐색 및 PCR cloning Gene bank에 등록되어 있는 기존 AlaRa의 conserved sequence를 바탕으로 primer를 제조하여 PCR을 수행한 결과 다양한 종류의 미생물 (E. coli, S. typhimurium, B. subtilis, B. stearothermophilus)로부터 예상되어진 480bp의 PCR fragment를 획득. 제한효소지도법에 의하여 각각의 균주의 AlaRa유전자 부분임을 확인. 제조된 Primer를 이용하여 절대공생미생물유래의 유전자를 PCR을 수행한 결과에서도 480bp의 PCR fragment를 cloning하여 염기서열을 분석한 결과?? SC-1유래의 alanine racemase 유전자부분을 확인. 6. 신규 절대공생미생물의 순수분리 및 단독배양과 계통학적 분류연구의 수행 가. 신규 절대공생미생물의 순수분리 및 단독배양 확립된 고온성 절대 공생미생물의 미생물배양 특성 - 배지 : 절대 공생미생물 배양용 배지는 공생균주인 Bacillus sp. SK-1의 단독배양액을 원심분리하여 상등액과 buffer를 1:1 로 혼합한 후, cell pellet을 extract로 만들어 추가하여 제조함. 이때 혐기호흡을 위한 전자수용체인 질산염과 영양원인 polypeptone 및 yeast extract를 첨가. - 배양 : 호기성 조건에서는 colony를 확인 불가능, 질산을 첨가한 배지를 이용하여 혐기성에서 혹은 microaerophilic한 조건에서 절대 공생미생물 colony를 확인 가능. Polypeptone 및 yeast extract도 생장에 필수적인 영양원 임을 확인. 절대 공생미생물의 최적 pH는 약 7.5이었으며, 최적 온도는 약 60。C 임을 확인. 하지만 이러한 최적 배양 조건에서도 혼합배양에 비해 매우 낮은 성장 수율(약 10 % 이하). 단독배양에서의 낮은 성장수율로 인하여 spectrophotometer를 이용한 세포의 성장을 측정하기는 어려웠으며, 작은 colony 크기로 인하여 viable count로도 세포의 성장을 측정하는 것은 불가능. - 세포성장의 측정 : 혐기성 배양 시 질산을 전자 수용체로 이용하여 성장하는 것을 확인하였으며, 이때 배지 내에 아질산을 축적하였다. 축적된 아질산은 발색법으로 정량이 가능하였으며 세포의 성장을 간접적으로 측정하는 수단으로 이용. 나. 혼합배양액을 기질로 이용한 절대공생미생물의 순수 분리 고온성 절대공생미생물과 공생균주인 고온성 Bacillus sp. SK-1의 혼합 배양의 배양액을 배지로 사용하여 신규 고온성 절대공생미생물의 single colony를 분리 사용한 고체 배지에는 질산염을 첨가하였으며 혼합 배양한 균을 접종(도말)하여 혐기성 조건하에서 배양 후 고온성 절대공생미생물 SC-1의 single colony는 약 0.1 mm 이하의 매우 작은 투명의 콜로니임을 확인. Single colony를 pick-up하여 gram 염색을 수행한 결과, 그람음성의 작은 간균으로 혼합배양시의 절대공생 미생물과 같은 형태이었으며, 이 미생물은 혼합배양시에 나타나는 tryptophan indole-lyase활성을 가지고 있음을 확인. 다. 첨단 HPLC, FPLC법의 및 절대공생미생물 순수배양법을 이용한 bioassay법으로 공생인자의 탐색 공생특성 - 절대 공생미생물 SC-1과 Bacillus sp. SK-1의 혼합배양시 SK-1의 성장후 stationary phase에서 SK-1의 lysis와 함께 절대공생미생물의 성장이 시작됨을 확인. 절대 공생 미생물 SC-1과 Bacillus sp. SK-1은 혼합배양시 현미경 상에서 직접적인 접촉을 하지 않는 것으로 관찰되어 확산에 의해 절대 공생미생물의 공생인자가 전달되는 것으로 판단. - SC-1의 성장액은 SK-1의 성장을 저해하는 물질을 함유하지는 않는 것으로 밝혀졌다. Bacillus sp. SK-1은 단독배양에서도 절대 공생미생물이 성장 할 수 있는 인자들을 생산. 공생인자의 탐색 - 공생에 관여하는 인자는 두 가지로 나누어 질 수 있었음. SK-1의 성장 시기에 세포외로 분비가 되며 열에 안정한 분자량 1,000 이하의 저분자 물질과 성장 말기에 세포내부에 생성되는 분자량 약 30,000 정도의 열에 불안정한 단백질성 물질이 절대 공생미생물의 성장에 필요함을 확인. - 세포내에서 생성되는 단백질성의 인자는 SK-1의 성장 말기에 세포의 lysis로 배양액으로 분비되어 절대공생미생물의 성장을 촉진하는 것으로 판단. 하지만 단독배양에서와 달리 혼합배양에서는 그림에서 보는 바와 같이 이들 두 가지 인자가 stationary phase에서 장시간 지속되어 절대공생미생물의 성장을 촉진시키는 양상을 보임. - SK-1을 각종 carbons source (glucose, succinate, acetate, glycerol, glutamate)를 이용한 minimal media에서 배양하였을 때 역시 이들 성장인자들을 생산을 확인. 현재 각종 첨단 chromatography법을 이용하여 이들의 정제를 시도하고 있음. 라. 16S rRNA 및 chemotaxonomy를 이용한 계통분류학적 연구 절대 공생미생물은 flagella를 보유하지 않으며 크기는 0.1-0.2 × 2-10μm. 절대공생미생물의 peptidoglycan은 meso 형태의 DAP에 의해 연결, 주요 quinone 성분은 menaquinone-7. 세포막의 주요지질성분은 phosphatidylethanolamine, 이 지질은 구성하는 주요지방산은 branched form과 straight form으로 이루어졌음을 확인 계통학적 분류를 위하여 16S rRNA염기서열 분석 결과, 고온성 절대공생미생물인 Symbiobacterium toebii SC-1은 16S rRNA DATA bank에 등록되어있는 어떠한 미생물 Group에도 속하지 않는 신규 미생물임이 확인. V. 연구개발결과의 활용 계획 국내 충남 공주지역의 퇴비에서 탐색·분리된 희귀 미생물인 신규 고온성 절대공생미생물인 Symbiobacterium toebii와 이러한 희귀 공생미생물과 상호 공생관계에 있는 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 균주가 보유하고있는 독특한 방향족 아미노산 생합성효소(tyrosine phenol-lyase와 tryptophan indole-lyase)와 미생물 세포벽 펩티도글리칸의 주성분인 D-아미노산 생합성효소 (D-amino acid aminotransferase와 glutamate racemase)들의 효소특성 및 유전자조작 연구를 수행하여 유용 아미노산 생산 생물전환기술을 개발하였으며, 이렇게 고온환경에서 분리된 신규 내열성 효소를 이용한 유용 아미노산 합성법은 기존의 화학합성공정에서 사용되는 화학적 보호기의 부가반응과 탈부가반응 등의 복잡하고 환경부적합형인 반응단계를 줄인 환경 친화적인 경쟁력 있는 새로운 기술로 판단되고 있다. 이상의 연구결과는 2편의 국외논문을 게재하였고, 본 연구와 관련된 기술을 정리하여 3편의 대한민국특허를 취득하였다. 또한 본 연구 결과는 생명공학연구소 국가지정연구실 과제인 "고부가가치 제약원료물질 생산을 위한 고기능 생물촉매기술"연구를 통하여 실용화 및 심화 연구를 통하여 적극 활용되고 있다. 특히 취득된 특허의 일부는 생명공학연구소 연구원 창업 벤처기업인 (주)바이오리더스로 기술이전을 통하여 산업화를 추진 중에 있으며, 희귀 공생미생물인 Symbiobacterium toebii SC-1의 게놈분석연구를 세계 최초로 수행 중에 있어 신규 미생물 유전자원의 확보 및 활용기술에 적극 기여할 것으로 기대되고 있다.

Abstract ▼

I. Title Enzymatic production of high value-added amino acids using thermostable enzymes of an obligatory symbiotic thermophile, Symbiobacterium toebii SC-1 II. Objective and Importance of Research To develop thermostable enzyme systems for the production of high value-added amino acids, we have st

I. Title Enzymatic production of high value-added amino acids using thermostable enzymes of an obligatory symbiotic thermophile, Symbiobacterium toebii SC-1 II. Objective and Importance of Research To develop thermostable enzyme systems for the production of high value-added amino acids, we have studied gene cloning, over-expression, enzyme characterization, and application in biocatalysis of following enzymes from Symbiobacterium toebii SC-1 or the symbiotic Bacillus sp. SK-1: tyrosine phenol-lyase, tryptophan indole-lyase, D-amino acid aminotransferase, and glytamate racemase. Enzymatic production of aromatic amino acids using tyrosine phenol-lyase or tryptophan indole-lyase originated from novel thermophilic Symbiobacterium toebii SC-1 Enzymatic production of D-amino acids using D-amino acid aminotransferase and glutamate racemase of Bacillus sp. SK-1 III. Scope and Content of Research 1. Mass production of recombinant biocatalysts for the production of high value-added useful amino acids Optimization of media composition and culture conditions High density culture of E. coli for the production of biocatalysts 2. Enzymatic production of aromatic amino acid derivatives Biocatalysis for the production of L-tryptophan derivatives using tryptophan indole-lyase (TNA) Optimization of reaction conditions 3. Improvement of biocatalysis for the production of D-amino acids Biochemical characterization of D-amino acid aminotransferase (D-AAT) from Bacillus sp. SK-1 Gene cloning and mass production of D-AAT and GluRa of Bacillus sp. SK-1 Molecular evolutionary characteristics of novel thermostable D-AAT and GluRa from Bacillus sp. SK-1 Application of D-AAT and GluRa from thermophillic Bacillus sp. SK-1 (Joint research with chemical research institute in Kyoto university, Japan) 4. Screening and gene manipulation of D-amino acid-synthesizing enzymes of novel Symbiobacterium toebii SC-1 5. Pure culture and phylogenetic analysis of novel Symbiobacterium toebii SC-1 Pure cultivation and studies on culture characteristics Phylogenetic study based on 16S rRNA sequence and chemotaxonomy Exploration and characterization of symbiotic factors IV. Result and Recommendation of Application Mass production of recombinant tyrosine phenol-lyase for the production of tyrosine was carried out with D-lactose induction system. Cell growth and enzyme production of the recombinant E. coli BL21 bearing the plasmid pTrc99A-TNA reached to O.D. 90 at 600 nm and 7.53 units per ml after cultivating for 18 hours in a rich medium containing 50g/L glycerol and 20g/L D-lactose. On SDA-PAGE analysis, expression yield was approximately 30% of soluble E. coli proteins. We investigated on the optimal reaction conditions of tryptophanase (TNA) from an obligatory symbiotic bacterium for the production of L-tryptophan and its derivatives. TNA activity was the maximum at 65 ℃, but we decided that 37℃ would be more adequate for the production of L-tryptophan considering the operational stability thereof. The enzyme showed the maximum activity at conditions of pH 9.0, 5 mM of indole, 200 mM of pyruvate, and 1.5 M of ammonia. Consequently 115 g/L of L-tryptophan was produced at the optimal conditions. D-AAT and GluRa of thermophilic Bacillus sp. SK-1 were cloned by genetic complementation of a glutamate auxotrophic Escherichia coli strain, sequenced, and characterized after purification. Although the deduced amino acid sequence of the SK-1 D-AAT was distinguishable from other enzymes (B. spaericus and Bacillus sp. YM1), it was quite similar with the YM-1 enzyme in the optimal reaction conditions, stability, and narrow substrate range. Catalytic properties of SK-1 GluRa was also similar to other non-thermophilic Bacillus enzymes excepting the thermostability. By employing the thermostable D-AAT and GluRa as biocatalysts for a multi-enzyme system for D-amino acid production, we could improve the productivity by 40%, eventually. A novel symbiotic thermophilic bacterium was isolated from a compost in Korea. This strain SC-1 isolate had obligately commensal interaction with a thermophilic Bacillus strain and hence essentially required crude extracts and culture supernatant of the Bacillus strain for its growth. Gram stain reaction of strain SC-1 was negative. Cells were non-spore-forming and non-motile rods without flagella. The isolate was microaerophilic heterotroph capable of utilizing yeast extract and polypeptone. Growth was observed between 45℃ and 70℃ (optimum: 60℃; 2.4 h doubling time) and pH 6.0 and 9.0 (optimum: pH 7.5). The G+C content of the genomic DNA was 65 mol % and the major quinones were MK-6 and MK-7. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA sequences placed this microaerophilic, high-G+C-content bacterium among the members of the Gram-positive, low G+C content anaerobic thermophilic bacteria within the Bacillus-Clostridium subphylum. The commensal interaction between strain SC-1 and a thermophilic Bacillus strain was elucidated partly. The strain SC-1 could be grown separately in the presence of fresh crude extracts and culture supernatant of the Bacillus sp. Therefore, the growth of strain SC-1 is essentially requires essential growth factors from its partner organisms. Even with the essential growth factors, growth of strain SC-1 was less than 0.1 at OD 600. Extracts from all eubacteria tested showed growth-stimulating activity on strain SC-1. The factors could not cross the ultrafiltration membrane (10 kDa cut-off) and we have found that the fraction (around 30kDa) of gel permeation chromatography showed the growth-stimulating activity. However, we could not detect any growth-stimulating activity after following column chromatography: ion exchange, hydrophobic, etc. We are currently trying to elucidate the obligate symbiotic interaction of strain SC-1.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...21
• 제 2 장 국 내 외 기 술 개 발 현 황...23
• 제 3 장 연 구 개 발 수 행 내 용 및 결 과...26
• 1. 고부가가치 유용 아미노산 생산 생물전환 기술 확립을 위한 재조합 생물촉매의 대량생산...26
• 2. 공생미생물 유래의 방향족 아미노산 합성효소를 생물촉매로 이용한 tryptophan 생산생물전환 반응의 최적 반응조건 연구...28
• 3. D-아미노산 생합성 효소 신규 내열성 D-AAT를 도입한 D-아미노산 생산 복합 생물전환기술의 개량 및 개선...28
• 가. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 D-AAT의 효소 특성연구...28
• 나.신규 고온성 Bacillus sp.SK-1 유래 D-AAT의 gene cloning 및 대량생산...33
• 다. Bacillus SK-1유래 신규 내열성 D-AAT의 아미노산 배열분석을 통한 유사 효소간 상동성 및 분자진화론적 특성연구...33
• 라. Bacillus SK-1 유래의 내열성 D-AAT를 생물촉매로 사용하여 저가의 기질인 D,L-aspartate로부터 D-alanine과 L-aspartate를 생산하는 생물전환반응의 산업적 추진을 검토...33
• 4. D-아미노산 생합성 효소 신규 내열성 GluRa를 도입한 D-아미노산 생산 복합 생물전환기술의 개량 및 개선...40
• 가. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 GluRa의 효소 특성연구...40
• 나. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래 내열성 GluRa의 유전자 조작 및 대량생산...40
• 다. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 내열성 GluRa의 아미노산 배열분석 및 유사 효소간 상동성...40
• 라. 신규 고온성 Bacillus sp. SK-1 유래의 내열성 GluRa를 생물촉매로 도입하여 고부가가치 방향족 D-아미노산 생산 복합 생물촉매계의 안정성을 개선하고 복합 생물촉매 전환반응의 산업적 이용기술을 검토...43
• 5. 신규 절대 공생미생물 유래의 신규 D-아미노산 생합성 효소의 탐색 및 유전자 조작...43
• 가.절대공생미생물 SC-1의 genetic com plem entation법에 의한 세포벽구성 D-아미노산 생합성 효소의 탐색...43
• 나. U niversal prim er제조 및 절대공생미생물 SC-1유래의 AlaRa 탐색...45
• 6. 신규 절대공생미생물의 순수분리 및 단독배양과 계통학적 분류연구...45
• 가. 신규 절대공생미생물의 순수분리 및 단독배양...45
• 나. 혼합배양액을 기질로 이용한 절대공생미생물의 순수 분리...47
• 다. 첨단 H PLC, FPLC법의 및 절대공생미생물 순수배양법을 이용한 bioassay법으로 공생인자의 탐색...47
• 라. 16S rRN A 및 chem otaxonom y를 이용한 계통분류학적 연구...51
• 제 4장 연 구 개 발 목 표 달 성 도 및 대 외 기 여 도...57
• 제 5 장 연 구 개 발 결 과 의 활 용 계 획...59
• 제 6 장 참 고 문 헌...60