박테리아 표면발현기술을 이용한 whole cell bioconversion 시스템 개발 Development of whole cell bioconversion system using the bacterial cell surface display technology
보고서 정보
주관연구기관
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2000-09
주관부처
과학기술부 Ministry of Science and Technology
등록번호
TRKO200200050631
DB 구축일자
2013-04-18
초록▼
Ⅰ. 제 목 박테리아 표면발현기술을 이용한 whole cell bioconversion 시스템 개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 연구개발의 목적 본 연구개발은 그람음성박테리아에서 새로운 모티프로 빙핵활성단백질을 사용하여 표면발현시스템을 개발하고 이를 이용하여 다양한 산업용 효소를 박테리아 표면에 발현하여 혁신적인 whole cell 생물전환시스템을 개발하는데 그 목적이 있다. 연구개발의 필요성 다양한 생물공학제품의 출현과 산업화로 효율적인 생산공정으로서의 생물전환공정의 중요성이 부각되고 있다. 이를 위하여 새로
Ⅰ. 제 목 박테리아 표면발현기술을 이용한 whole cell bioconversion 시스템 개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 연구개발의 목적 본 연구개발은 그람음성박테리아에서 새로운 모티프로 빙핵활성단백질을 사용하여 표면발현시스템을 개발하고 이를 이용하여 다양한 산업용 효소를 박테리아 표면에 발현하여 혁신적인 whole cell 생물전환시스템을 개발하는데 그 목적이 있다. 연구개발의 필요성 다양한 생물공학제품의 출현과 산업화로 효율적인 생산공정으로서의 생물전환공정의 중요성이 부각되고 있다. 이를 위하여 새로운 생물전환기술의 개발, 특히 유전공학기술을 이용하여 living-cell biocatalyst 이용기술의 개발, 이를 이용한 고생산성 생물전환공정을 실현하게 되면 생물전환공정의 경제성을 제고할 수 있다. 값비싼 효소의 대체 방법으로 생산코스트를 낮춤과 동시에 반응 중의 실활 등의 안정성 문제를 부분적으로 해결하는 whole cell bioconversion기술은 비특이적반응, 세포내로의 물질전달 및 효소역가의 실활문제가 미해결된 상태이다. 따라서 이러한 기존의 whole cell bioconversion 기술을 개량할 수 있는 기술이 필요한 실정이다. 이러한 문제점을 개선하는 혁신적인 기술은 미생물 세포 표면에 원하는 효소를 발현하여 전체 미생물 균체를 고정화의 support material로 이용할 수 있는 whole-cell bioconversion system이 그 대안이 될 수 있다. 즉 효소를 발현하고 분리정제하지 않고 미생물을 배양하면 바로 효소가 coating된 미생물균체를 biocatalyst로 이용하게 되는 기술이 표면발현기술의 발전으로 가능하게 되었다. 이러한 가능성의 증가로 보다 적극적으로 표면의 학문적 산업적인 이용이 가능하게 될 것으로 예상된다. 표면발현기술의 가장 중요한 것은 외래단백질을 fusion하여 발현시켰을 때 효과적으로 표면에 발현시킬 수 있는 표면단백질 모티프를 확보하는 것이다. 이러한 시스템은 위에서 열거한 일반 whole cell bioconversion의 문제들- 비특이적 부반응, 안정성, 생산코스트-을 해결할 수 있는 방법이 될 것이다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 본 연구개발은 먼저 그람음성박테리아에서의 표면발현시스템을 개발하고 이를 응용하여 다양한 whole cell 생물전환시스템에 확대적용하는데 있다. 따라서 표면발현기술의 개발을 위하여 먼저 신규 표면발현모티프인 빙핵활성단백질을 이용하여, 1) 박테리아의 표면에 효소를 발현할 수 있는 발현시스템을 확립하고, 2) 표면발현됨을 물리화학적으로 증명하여, 3) 효소가 표면발현된 미생물을 직접 이용한 whole cell bioconversion 기술의 가능성을 확인하는데 일차 연구목표가 있다. 이러한 표면발현기술의 확대적용을 위해서 다음과 같은 발현최적화와 적용분야의 개척에 2차 연구의 목표을 두었다. 1) 표면발현 vector/host 시스템을 최적화하고, 2) 효소가 표면발현된 미생물를 이용한 whole cell bioconversion 시스템의 최적공정연구, 3) 기술의 확대적용의 일환으로, 표면발현된 효소(sucrase)를 이용한 숙주세포의 사용기질의 범위를 확대하는 방법과 non-antibiotic selective marker로의 이용과 리파제를 미생물의 표면에 발현함으로써 유기용매내에서의 생물전환을 할 수 있는 발현계의 개발이 본 연구의 목적이다. Ⅳ. 연구개발결과 본 연구개발 결과 주요 내용은 다음과 같다. 1. Pseudomonas syringae KCTC1832로부터 분리된 빙핵활성단백질 유전자의 염기서열를 결정하여 NCBI 유전자은행인 GenBank에 accession 번호 AF013159로 등록하였다. 2. 결정된 염기서열로부터 빙핵활성단백질을 표면발현모티프로 사용하기 위하여 번역정지코돈을 없애고 외래유전자삽입을 위해 여러 제한효소인식부위를 새롭게 PCR (Polymerase chain reaction)기술을 이용하?터로 형질전환된 숙주세포는 빙핵활성능이 완전히 제거되었다. 4. 고초균유래 CMCase와 Zymomonas mobilis유래의 levansucrase 을 표면발현벡터에 서브클로닝하여 발현하여도 숙주세포의 증식속도나 빙핵활성능에는 변화가 없이 안정하게 발현되었다. 빙핵활성단백질에 의해 표면발현된 CMCase는 대수증식기에 발현된 효소의 대부분과 성장휴지기에서 85% 이상은 세포표면에 부착되어 발현되었다. 5. 표면발현된 CMCase와 levansucrase의 여러 가지 물리화학적, 면역학적인 방법으로 증명하였다. 6. 표면발현된 효소에 의해 숙주세포의 외막의 구조적 안정성과 숙주세포의 생존력에는 영향을 주지않았다. 7. 대장균에서의 표면발현 최적화를 위하여 다양한 균주를 선별한 결과 JM109이 가장 좋았으며 세포외막에 존재하는 OmpT 프로테아제가 결핍된 변이주에서는 표면발현이 좋았다. 8. 숙주세포 성장정지기에 유도하는 프로모터을 사용하여 성장정지기 세포표면발현계을 개발하였다. 9. 기술의 확대적용을 위하여 Zymomonas mobilis유래 sucrase와 Pseudomonase fluorescens유래 열안정성 lipase을 빙핵활성단백질을 이용하여 표면발현하였다. 표면발현된 sucrase는 숙주세포에 증식할 수 있는 기질의 범위를 넓히는 기능을 주었고 이를 이용한 non-antibiotic positive selection marker로의 응용이 가능하였다. 10. 본 연구결과 표면발현 모티프로 개발된 빙핵활성단백질은 박테리아에서 발견된 유일한 GPI (glycosyl phosphatidylinositol) anchor로서 eukaryote에서와 같은 세포표면에 단백질을 안정하게 부착발현시키는데 혁신적인 방법을 제공하며 현재까지 개발된 다른 어떠한 박테리아 표면발현모티프보다도 안정하고 우수하였다. 8. 빙핵활성단백질은 그 C말단에 효소를 부착하여 발현하여도 빙핵활성능을 유지하고 있기 때문에 whole cell conversion 후 산업적으로 동결농축, 동결건조와 같은 공정을 통하여 최종 산물을 손쉬운 방법으로 분리정제할 수 있는 이중의 잇점을 지니고 있다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 본 연구 개발로 확보된 빙핵활성단백질을 이용한 새롭고 혁신적인 박테리아 표면발현기술은 이미 상업화되어 단백질-단백질 상호작용 연구에 사용되는 phage display와 경쟁 또는 보안기술로 발전하고 있다. 본 연구개발에서 예시했듯이 생물전환용 효소의 표면발현을 통한 신규 whole-cell bioconversion이 가능하게 되었다. 특히 효소나 항체의 라이브러리를 박테리아 표면에 발현하여 FACS (fluorescence-assisted cell sorting) 기능을 갖는 flow cytometry을 이용하여 시간당 108이상의 세포를 분석하여 탐색할 수 있는 기술이 셋업되고 있어 그 기술의 진보성이 증명되고 있다. 따라서 본 연구개발로 확립된 표면발현기술은 산업용 효소의 방향성 진화 (directed evolution)와 항체의 산업적인 확보에 응용한다면 보다 폭넓은 분야에 응용이 가능한 핵심기반기술로 발전할 것으로 예상된다.
Abstract▼
In order to develop a novel bacterial cell surface display system, an ice-nucleation protein (INP, InaK) from Pseudomonas syringae KCTC1832 was used as an anchoring motif in Escherchia coli. The INP gene (inaK) was seqeunced and its DNA sequence was deposited at GenBank of NCBI as an accession numbe
In order to develop a novel bacterial cell surface display system, an ice-nucleation protein (INP, InaK) from Pseudomonas syringae KCTC1832 was used as an anchoring motif in Escherchia coli. The INP gene (inaK) was seqeunced and its DNA sequence was deposited at GenBank of NCBI as an accession number, AF013159. The INP is composed of three characteristic domains, the N-terminal specific domain (179 aa), the central repeating domain, and the C-terminal specific domain (49 aa). As a surface anchoring motif, the INP has the following characteristics: 1) it can be expressed highly and stably on the outer surface, 2) the central repeating domain can be adjustable as a linker for fusion proteins, 3) the ice-nucleation activity (INA) can be utilized for further processing, such as freeze concetration, freeze drying, etc., because the INP-fusion protein has INA, 4) Growth inhibition of host cells is not observed, 5) the INP-fusion proteins can be expressed in various Gram-negative bacteria, and 6) The INP is a GPI (glycosylphosphatidylinositol)-like anchor protein which is well known in eukaryotic cell surface proteins and used for surface display of proteins on eukaryotic cell surface. For insertion of a foreign protein gene at the end of the C-terminus of INP, translational stop codon was removed and the multicloning site of restriction enzymes was created by using PCR (polymerase chain reaction) technique. An alternative INP display vector was constructed by removing the central repeating domain, resulting the contruct having only the N-terminal and C-terminal domains of the INP. As a model enzyme to be displayed on Escherichia coli surface, a carboxymethylcellulase (CMCase) from Bacillus subtilis and levansucrase from Zymomonas mobilis has been selected because its substrate (carboxymethylcellulose, CMC) and product (levan, a fructose polymer) are polymers which can not be transported through outer membrane. Expression of INP-fusion enzymes was confimed by SDS-PAGE and Western bloting. The presence of fusion proteins on the cell surface was tested by several immunological techniques (fluorescence microscope, FACS flow cytometry, immunogold electron microscope) and biochemical techniques (whole cell enzyme activity, protease attack test, INA measurement). The outer membrane integrity was maintained and the host cell was viable even in the stationary phase of the culture. For optimal expression of the INP-fusion enzymes, Escherichia coli JM109 was selected as a host cell and OmpT, an outer membrane protease, mutant was helpful. The stationary phase expression by using a stationary phase active promoter, such as trp or bolA1 promoter, was a good alternative to preparing whole cell enzyme source. Sucrase from Zymomonas mobilis was also displayed on Escherichia coli using the INP. E. coli cells expessing sucrase on the surface could grow on sucrose as a sole carbon source, which may become a non-antibiotic positive selection marker. This result showed that enzymes displayed on the surface of host cells can be used for broadening substrate spectrum. Lipase expressing E. coli cells on the cell surface was used for whole cell hydrolysis of lipid in aqueous two phase reaction system. The INP bacterial cell display system of the present study provides a technology platform for in vivo immobilization of enzymes on the bacterial cell surface, and the high-throughput selection tools for directed evolution of industrial enzymes and antibodies.
목차 Contents
제 1 장 서론...12
제 2 장 국내의 기술개발 현황...14
2.1. 박 테 리 아 표 면 발 현 기 술...14
2.2. 국 내 의 기 술 개 발 현 황...30
제 3 장 연 구 개 발 수 행 내 용 및 결 과...31
3.1. 신 규 대 장 균 표 면 발 현 시 스 템 개 발...31
3.1.1. 연 구 수 행 전 략...31
3.1.2. 연 구 결 과...32
3.1.3. 고 찰 및 결 론...45
3.2. 빙 핵 활 성 단 백 질 표 면 발 현 시 스 템 의 최 적 화...49
3.2.1. 표 면 발 현 벡 터 /숙 주 세 포 시 스 템 의 발 현 최 적 화...49
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