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본 연구에서는 Gram 음성 박테리아인 Pseudomonas syringae 유래의 빙핵 활성 단백질을 이용한 cell surface display를 이용하여 hydrophobicity 때문에 발현하기 힘든 lipase를 대장균 표면에 발현시켰다. Bacillus thermoleovorans ID-1 유래의 lipase를 세포 외막 단백질인 빙핵 활성 단백질의 C- 말단에 융합 시켜 대장균 표면에 발현시켰다. LB/tributyrin plate에서 clear zone을 확인함으로써 lipase가 대장균 표면에 발현되었음을 확인하였다. ...

본 연구에서는 Gram 음성 박테리아인 Pseudomonas syringae 유래의 빙핵 활성 단백질을 이용한 cell surface display를 이용하여 hydrophobicity 때문에 발현하기 힘든 lipase를 대장균 표면에 발현시켰다. Bacillus thermoleovorans ID-1 유래의 lipase를 세포 외막 단백질인 빙핵 활성 단백질의 C- 말단에 융합 시켜 대장균 표면에 발현시켰다. LB/tributyrin plate에서 clear zone을 확인함으로써 lipase가 대장균 표면에 발현되었음을 확인하였다. 세포막을 분리하여 빙핵 활성 단백질이 세포막에 위치함을 확인하였다. 또한 세포 표면 발현된 E. coli는 M9 minimal t ributyrin 배지에서 성장하였다. 이와 같은 현상은 미생물 내로 들어갈 수 없는 거대 분자인 기질을 세포표면의 효소가 분해하고 그 기질의 분해산물을 미생물이 이용하여 생육하였으므로 효소 활성과 미생물의 생육을 연결시켜 lipase mutant library로부터 원하는 클론을 얻을 수 있는 고속 스크리닝법으로 활용할 수 있었다. error-prone PCR에 의해 변이된 lipase library를 빙핵활성 단백질을 이용하여 대장균 표면에 발현시키고 이 screening을 이용하여 mutant lipase의 비활성을 측정한 결과 활성이 약 1.5배 증가한 lipase mutant를 얻었다.

Abstract ▼ AI-Helper

A new system designed for the cell surface display of recombinant proteins on Escherichia coli has been evaluated for the expression of lipase of Bacillus thermoleovorans. Genetic element encoding the lipase was fused to the C-terminus of ice nucleation protein (Inp), an outer membrane protein of Ps...

A new system designed for the cell surface display of recombinant proteins on Escherichia coli has been evaluated for the expression of lipase of Bacillus thermoleovorans. Genetic element encoding the lipase was fused to the C-terminus of ice nucleation protein (Inp), an outer membrane protein of Psedom onas syringae, and expressed on the surface of E. coli. SDS-PAGE and western blotting analysis confirmed the successful expression of the lipase on the surface. When measured by whole cell lipase assay u ing ρ -nitrophenol as substrate, lipase activity was similar to that of B. therm oleovorans. Thermophilic lipase variants with improved activity were prepared by the bacterial surface display method. A library of mutated lipase genes generated by error-prone PCR was fused to the ice nucleation protein(Inp) gene so that the resulting fusion proteins would be displayed on the bacterial cell surface. Some cells displaying mutant proteins grew more rapidly on M9 tributyrin plate than wildtypes did. When analyzed for the hy drolytic activity, these rapidly growing clones showed higher hydrolytic activity than clones with the parent lipase. Increased lipase activity was confirmed by assaying the specific activity of wild type whole cell after the expression of the variant genes on the cell surface. A fused form of clones showed the highest lipase activity that was about 1.5- fold increase compared to the parental lipase. These results demonstrate that the bacterial surface display of enzyme libraries is a direct way to correlate improved enzyme activity with the microbial growth rates. This technique will provide a useful technology plat form for directed evolution and high-throughput screening of industrial enzymes, in cluding hydrolases

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