인터페론감마 활성화인자 (IGIF)의 종양억제 면역기능 검색 및 간 적중 HBV 벡터의 개발 Antitumor Effects of Adenovirus Vector encoding Interferon-gamma-inducing Factor (IGIF: IL-18) in Murine Tumor Models and Development of a Gene Transfer Vector derived from Hepatitis B Virus
보고서 정보
주관연구기관
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2000-07
주관부처
과학기술부 Ministry of Science and Technology
등록번호
TRKO200200050656
DB 구축일자
2013-04-18
초록▼
Ⅰ. 제 목 인터페론감마 활성화인자 (IGIF: IL-18)의 종양억제 면역기능 검색 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 유전자 조작기술의 발달과 더불어 종양, 선천성 질환 등과 같이 현존의 기술로는 치료하기 어려운 소위 난치성 질환을 치료할 수 있는 기술 분야의 연구가 급속히 팽창하고 있다. 이 기술 분야가 이른바 유전자를 이용하여 질병을 치료하려는 분야이다. 난치성 질환중의 하나인 종양은 유전학적인 요인에 근거하고 있다는 것이 최근 세포생물학, 분자 유전학의 연구결과에서 자명하게 입증되고있으며 종양치료제 개발을
Ⅰ. 제 목 인터페론감마 활성화인자 (IGIF: IL-18)의 종양억제 면역기능 검색 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 유전자 조작기술의 발달과 더불어 종양, 선천성 질환 등과 같이 현존의 기술로는 치료하기 어려운 소위 난치성 질환을 치료할 수 있는 기술 분야의 연구가 급속히 팽창하고 있다. 이 기술 분야가 이른바 유전자를 이용하여 질병을 치료하려는 분야이다. 난치성 질환중의 하나인 종양은 유전학적인 요인에 근거하고 있다는 것이 최근 세포생물학, 분자 유전학의 연구결과에서 자명하게 입증되고있으며 종양치료제 개발을 위한 지난 수십 년간의 인류의 끊임없는 연구개발 투자에도 불구하고 효율적인 치료수단은 아직까지 개발되지 않고 있다. 다양한 종류의 유전자 (암 억제 유전자, 세포사멸유도 유전자 등)를 이용하여 종양을 치료하려는 노력에 힘입어 성공적인 결과가 부분적으로 기대되고 있지만 종양을 효율적으로 치료할 수 있는 새로운 기능을 가진 치료 유전자를 이용한 유전자 치료기술 연구는 보다 보편적인 이 기술의 실용화를 위하여 필수적으로 수행되어야 한다. 종양의 가장 이상적인 치료 유전자는 종양 세포를 체내에서 완전히 제거할 수 있는 능력을 가진 유전자 일 것이다. 종양 치료의 경우 수술과 같은 외과적 수단에 의하여 거시적인 종양세포들을 제거할 수 있으나 미시적으로 존재하는 종양화된 세포들에 의한 종양의 재발은 빈번하다. 종양의 유전자 치료를 위하여 다양한 치료 유전자가 이용되고 있다. 그러나, 현존하는 유전자 전달벡터들의 유전자 전달효율을 고려할 때 치료 유전자는 극히 일부분의 암세포에만 전달, 발현된다. 면역반응촉진 인자를 이용하여 종양을 치료할 경우 일부분의 종양세포에 치료유전자가 도입되더라도 종양 특이적 신체면역반응이 유도되면 치료유전자가 도입되지 않은 암세포도 제거될 수 있으므로 효율적인 종양의 유전자치료가 될 수 있다. 1995년도에 생쥐에서 신규로 분리된 인터페론 감마 생성 활성화 인자 (interferon-γ inducing factor:IGIF; Interleukin(IL)-18)는 종양억제 신체면역 기능을 유도할 수 있는 유전자이다. IL-18의 기능은 T세포에 의한 IFN-γ 생성분비촉진, Natural Killer(NK) 세포의 활성화 및 활성화된 T세포의 증식을 촉진하는 기능 등을 갖고 있으므로 종양에 대한 신체 면역 반응유도에 유용한 유전자일 수 있다. 따라서 IL-18 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 종양을 유전자로 치료하는 기술을 확립하기 위하여 본 연구를 수행할 필요성이 있었다. IL-18은 IL-12와 아주 유사한 기능들을 갖고 있으나 IL-12보다 potency가 높은 것으로 보고되었다. 그러나 IL-18는 약 21kDa의 전구체(pro-IL-18)로서 세포에서 합성된 다음 interleukin-1β converting enzyme (ICE:Caspase-1)에 의해 processing되어 약 18 kDa의 IL-18이 생성되고 세포 밖으로 분비되어 상기한 기능을 나타낸다. 다른 한편으로 IL-18은 caspase-3에 의해 분해되어 그 기능이 상실된다. 따라서 본 연구에서는 proIL-18 단백질이 ICE에 비의존적으로 세포밖으로 분비되고, caspase-3에 의해 분해되지 않는 IL-18 mutants가 도입된 아데노바이러스 벡터들을 제작하고 생쥐 종양모델에서 종양 치료효능이 향상되는지를 규명하는 연구를 목표로 하였다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1. IL-18 유전자의 클로닝 - 사람과 생쥐의 IL-18 유전자의 클로닝 및 발현 - MBP와 IL-18의 융합단백질의 대장균 내 발현 및 IL-18에 대한 항체 제작 - 발현된 IL-18 단백질의 T 세포 증식 효과 검증 - 항암효능이 증가된 IL-18 변이체들의 제작 및 활성 검증 2. IL-18 유전자 및 IL-18 mutants 유전자가 도입된 재조합 아데노바이러스의 제작과 특성 규명 - CaPO4 transfection 방법을 이용?? DNA의 분리 - HeLa 세포주에서 발현된 IL-18 단백질의 확인 - 제작된 재조합 아데노바이러스의 생물학적 활성 (인터페론 감마 유도능) 검증 3. 사람의 Caspase-1 (ICE) 유전자가 도입된 재조합 아데노바이러스의 제작과 세포사멸 기능 검증 - 사람의 Caspase-1 (ICE) 유전자의 클로닝 - Caspase-1 유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터의 제작 - 제작된 Ad.ICE 바이러스의 세포 사멸 유도기능 검증 4.생쥐종양모델에서의 Ad.IL-18 바이러스들의 항암 효능 및 작용기작 규명 - 동물실험용 재조합 Ad.IL-18 바이러스들의 분리 및 정제, titer 검증 - 생쥐 신장암세포주(Renca cell)를 이용한 종양모델의 형성 - BALB/c nude생쥐에서 Huh-7 간암세포주를 이용한 종양모델의 형성 - 재조합 아데노바이러스의 종양세포내 투여 - 종양 증식 억제 효과 검증 - 종양세포 특이적인 세포 독성 임파구 유도능 검증 - Natural killer cell 활성도 측정 Ⅳ. 연구개발결과 1. IL-18 유전자와 변이체가 도입된 재조합 아데노바이러스의 제작과 기능 확인 생쥐의 IL-18 유전자의 클로닝과 활성 확인: 생쥐의 대식세포로부터 RT-PCR로부터 IL-18유전자를 클로닝하였고 염기서열분석을 수행하여 확인하였다. 클로닝한 IL-18 유전자의 발현과 활성을 알아보고자 대장균에서 융합단백질로 발현시켰다. 발현된 mIL-18 단백질이 생쥐의 비장세포에 처리하였을 때 T 세포 증식효과가 있음을 확인할 수 있었다. mIL-18CPP32-와 GMmIL-18 변이체의 클로닝: Caspase-3에 의해 불활성화되지 않도록 Caspase-3의 인식부위를 site-directed mutagenesis 방법으로 치환한 IL-18(CPP32-)와 또한 mature IL-18의 N-말단에 GM-CSF의 signal sequence를 첨가하였다. 이 두 변이체들도 염기서열분석으로 확인하고 재조합 아데노바이러스 제작에 사용하였다. 재조합 아데노바이러스 Ad.mIL-18, Ad.mIL-18CPP32-, Ad.GMmIL-18의 제작과 발현, 기능 확인: 클로닝된 IL-18 유전자와 변이체를 아데노바이러스 transfer 벡터에 각각 클로닝하고 아데노바이러스 transfer 벡터와 아데노바이러스 모체 벡터인 pBHG10을 293 세포주에 cotransfection하여 상동재조합에 의한 방법으로 아데노바이러스 E1 부위에 IL-18 유전자가 도입된 바이러스들을 제작하였다. 바이러스의 DNA를 추출하여 제한효소 분석과 PCR을 사용하여 IL-18 유전자가 도입되었음을 확인할 수 있었으며 단백질의 발현을 HeLa 세포주를 사용하여 확인하였다. Ad.mIL-18 바이러스로 감염된 HeLa 세포의 세포추출액과 배지를 생쥐의 비장세포 내의 T 세포와 함께 반응시키고 인터페론 감마형성을 유도한 결과 대조군에 비해 Ad.mIL-18 바이러스로 감염된 HeLa 세포주의 세포추출액과 배지에서 많은 양의 인터페론 감마형성 능력이 있음을 확인하여 mIL-18이 발현되어 생물학적 활성을 지니고 있음을 알 수 있었다. Ad.mIL-18의 세포사멸 유도현상 규명: Ad.mIL-18 바이러스를 HeLa 세포주에 감염시켰을 때 시간이 지남에 따라 세포가 사멸되는 현상이 발견되었다. Ad.mIL-18 바이러스의 감염 후 사멸되는 HeLa 세포에서 세포사멸 관련 단백질인 p53과 p21, Caspase-1의 발현이 증가되었다. 감염된 HeLa 세포를 FACS 분석을 하였을 때 Ad.mIL-18 바이러스로 감염된 세포가 세포주기 중 G2M 단계에서 정지 (growth arrest)하였다. Ad.mIL-18 바이러스로 감염된 세포에서 defective adenovirus를 다량으로 존재하는 것처럼 보였다. Ad.mIL-18 바이러스에는 defective 바이러스들이 많이 존재하여 HeLa 세포의 사멸을 유도할 것으로 추측되었다. 사람의 IL-18 유전자와 변이체가 도입된 재조합 아데노바이러스의 제작: 사람의 IL-18도 염기서열 분석으로 확인하고, 생쥐의 IL-18 유전자와 마찬가지 방??는 Caspase-3에 의해 불활성화되는 aspartic acid 부위를 site-directed mutagenesis 방법으로 glutamic acid로 치환하였다. 변이체를 아데노바이러스 transfer 벡터에 클로닝하고 발현확인 후 293 세포주를 사용하여 아데노바이러스 (Ad.hIL-18(CPP32-)를 제작하였다. 제작된 재조합 아데노바이러스 Ad.hIL-18, Ad.hIL-18CPP32-의 발현: 재조합 아데노바이러스 Ad.hIL-18와 Ad.hIL-18CPP32-의 바이러스 DNA를 추출하여 제한효소로 분석하고 PCR로 IL-18유전자가 존재함을 검증하였으며 HeLa 세포주를 사용하여 발현된 단백질도 확인하였다. 2. 사람의 Caspase-1 (ICE) 유전자가 도입된 재조합 아데노바이러스의 제작과 세포사멸효과 확인 사람의 단핵세포주 THP-1로부터 클로닝된 ICE 유전자가 도입된 아데노바이러스를 제작하였고 ICE 단백질들의 발현을 확인하였다. 바이러스로 감염된 세포의 생존율을 조사하였을 때 대조군 바이러스에 비해 많은 세포가 사멸되는 효과를 확인할 수 있었다 3. 재조합 아데노바이러스 Ad.CMV.mIL-18, Ad.CMV.GMmIL-18의 항암효과검증 생쥐 신장암세포주가 피하에 접종된 생쥐 종양모델에 Ad.IL-18바이러스들을 일회 intratumoral injection하였을 때 IL-18 유전자가 도입된 종양에서 대조군에 비해 현저히 종양억제효과가 나타났으며 GM signal sequence가 부가된 경우에서 더 현저한 종양증식저해 효과가 나타났다. 이 실험을 반복하였을 때 대조군보다 Ad.CMV.GMmIL-18에서 종양증식의 저해 효과가 재현성 있게 나타났다. 대조군의 경우 종양이 현저하게 증식하지 않은 경우는 4/20 이었으며, Ad.CMV.GMmIL-18를 주사한 경우 12/20에서 partial 및 complete regression이 나타나 통계적으로 유의성이 있었다. 종양증식 억제가 일어난 경우에 암세포 특이적인 세포독성 임파구가 유도되었고, NK 세포가 활성화되어 있는 것을 검증할 수 있었다. 4. 재조합 아데노바이러스 Ad.CMV.hIL-18CPP-와 Ad.CMV.ICE의 병합요법의 항암효과검증 Balb/c-nude 생쥐에 Huh-7 생쥐 간암세포주를 피하에 주사하여 종양결절을 형성시킨 후 종양결절의 직경이 4 - 5 mm 되었을 때 재조합아데노바이러스를 결절내 주입한 결과 대조군에 비해 Ad.hIL-18CPP-와 Ad.ICE의 병합요법을 한 경우에서 가장 큰 종양성장 억제효과를 나타내었다. 초기 결절의 크기가 직경 4 - 5 mm 인 경우 Ad.IL-18 바이러스의 항암효과가 나타났으며 tumor volume이 큰 경우에는 Ad.IL-18바이러스의 항암효능은 현저하지 않았다. 종양증식 억제효과가 관찰된 경우 NK 세포 활성도가 크게 증가함을 알 수 있었다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 본 연구팀의 연구 결과는 IL-18을 이용한 종양의 유전자 치료의 산업화가 가능할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 이 연구결과를 실용화하기 위하여 다음과 같은 추가연구가 필요한 것으로 사료되었다. 종양세포에 주입한 면역반응 유전자가 종양세포 에 대한 면역반응을 효과적으로 유도하기 위하여 종양세포에서 생성된 면역반응 유도인자가 세포 밖으로 분비되어 종양조직 부위에 면역세포들을 효과적으로 응집하고, 활성화 시킬 수 있어야 한다. pro-IL-18이 세포 내에서 합성되고 Caspase-1에 의해 mature IL-18으로 전환되어 세포 밖으로 분비되어 그 활성을 나타내며 IL-18은 대부분의 세포가 갖고 있는 Caspase-3에 의해서는 불활성화 된다. 따라서 IL-18의 활성을 종양의 유전자 치료 시에 최대화하기 위하여 세포 내에서 합성된 IL-18이 caspase-3에 의해 불활성화되지 않도록 함과 동시에 세포 내에서 합성된 IL-18의 세포외 분비가 caspase-1에 의존적이지 않은 mutant IL-18를 제작하여 그 항암활성을 규명하는 연구가 중요할 것으로 보인다. 작용 기작이 상이한 종양 치료용 유전자들을 병합하여 종양치료 효율을 향상시키는 기술(combination cancer gene therapy)에 본 연구팀의 연구결과는 활용될 수 있다. rIL-12와 rIL-18 단백질을 함께 사용하였을 때 각각의 경우보다 현저한 항암효능이 관찰되었다. 그러나 재조합 단백질을 이용할 경우 독성이 발생한다. 이러한 연구결과는 Ad.IL-18과 Ad.IL-12 유전자를 병합하여 종양을 치료할 경우 각각의 경우보다 강력한 세포성 면역반응유도를 통하여 높은 치료효능을 유도하며 낮은 독성을 일으킬 것으로 예측된다. 이러한 병합 유전자 치료기술은 암 치료 효율 향상에 필수적인 수단이 될 것으로 보이며 이를 검증하기 위하여 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이러한 연구가 수행되어야만 산업화가 확실해 질 것으로 보인다. 생쥐 종양모델에서 Ad.mIL-18의 항암효능을 검증하기 위하여 Ad.mIL-18 바이러스를 293세포주에서 증폭시켜 감염성 입자를 293세포주에서 plaque assay를 통하여 검증한 결과 현저하게 감염성 바이러스 입자 (infectious adenovirus particle)가 적은 것을 발견하였다. 이 현상은 재현성이 있었다. 이 결과는 293세포주에 Ad.IL-18에 의해 발현된 IL-18이 아데노바이러스 복제 및 입자생성에 영향을 주어 defective adenovirus 입자가 생성되는 것으로 추정해 볼 수 있다. IL-18의 defective adenovirus 생성 유도기전을 규명하는 연구는 감염성 Ad.IL-18바이러스를 효과적으로 생산하는 기술에 할용할 수 있다.
Abstract▼
Gene therapy of human cancer is under intensive investigation. Cancer immuno-gene therapy has been a challenging but promising modality among various gene therapeutic approaches for the treatment of cancer, as it may have a great potential abrogating malignant tumor cells under microenvironment by
Gene therapy of human cancer is under intensive investigation. Cancer immuno-gene therapy has been a challenging but promising modality among various gene therapeutic approaches for the treatment of cancer, as it may have a great potential abrogating malignant tumor cells under microenvironment by generating tumor-specific immune responses of the host. It appears that any gene transfer system using viral or nonviral vectors currently available can not deliver therapeutic genes into all the tumor cells. However, immune-stimulatory genes do not necessarily have to be delivered into all the tumor cells, as far as a small portion of tumor cells expressing them may be able to trigger systemic, tumor-specific immune responses of the host. IL-18 previously known as interferon-gamma-inducing factor (IGIF) is a newly cloned murine and human cytokine. It is synthesized by activated macrophages and has a structural relationship to the IL-1 family. Precursor IL-18 is processed by IL-1β converting enzyme and is cleaved into mature IL-18. IL-18 induces IFN-γ production by murine helper T cells and NK cells and stimulates T-cell proliferation and activates natural killer (NK) cell. Moreover, IL-18 augments the Fas ligand-mediated cytotoxic activity of the Th1 clone and the NK cell clone. Thus, IL-18 shares some biological activities with IL-12, although no significant homology between the two cytokines has been detected at the protein level. Furthermore, treatment with IL-18 and IL-12 has a synergistic effect on IFN-γ production. Because of the immunological functions of IL-18 such IFN-γ production, stimulation of T-cell proliferation, activation of NK cells, a number of studies on the antitumor effect of recombinant IL-18 protein has been carried out and revealed that the antitumor effect of IL-18 occurs by stimulating initially a nonspecific arm of the immune response such as activation of NK cells and subsequently by the development of a specific CTL response. In this study, we investigated antitumor effects of IL-18 gene by using adenovirus vector and its action mechanism in murine tumor models. Adenovirus vectors have been used extensively in cancer gene therapy, as they deliver therapeutic genes into cells or tissues efficiently and transduced genes are expressed transiently and strongly. Long-term expression of therapeutic genes may not be absolutely required in cancer gene therapy using immune-potentiating genes. Therefore, adenovirus vector among other gene transfer systems is a suitable delivery system of IL-18 gene for the treatment of cancer. We cloned murine and human IL-18 genes and constructed replication-defective adenovirus encoding the IL-18 genes. The expression of IL-18 in the virus-infected cells was detected by Western blots. The expressed IL-18 contained interferon-γ inducing activity. A single injection of the adenovirus encoding IL-18 into tumor nodules of the Renca tumor-bearing mice resulted in a significant antitumor effect. We detected an induction of tumor-specific cytotoxic T-lymphocyte and an activation of NK cells in the tumor-bearing mice by the injection of adenovirus encoding IL-18. The antitumor effect of the adenovirus was observed in the nude mice subcutaneously transplanted with Huh-7 human hepatoma cells. In this case was an activation of NK cell also detected. Thus the results suggest that adenovirus encoding IL-18 have a potential use for the treatment of human cancer.
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