초록
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Ⅰ. 제 목 동맥경화(고지혈증)와 고혈압의 연결고리 유전자 탐색 및 활성유용물질 개발 (뇌졸중(중풍) 위험인자 발굴을 위한 기초 연구) Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 고지혈증과 고혈압은 심혈관질환의 발병에 밀접하게 ...
Ⅰ. 제 목 동맥경화(고지혈증)와 고혈압의 연결고리 유전자 탐색 및 활성유용물질 개발 (뇌졸중(중풍) 위험인자 발굴을 위한 기초 연구) Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 고지혈증과 고혈압은 심혈관질환의 발병에 밀접하게 상호 관련이 되어있다. 또한 두 질병은 상호 작용에 의하여 서로 상승 작용이 있으므로, 기존의 독립된 연구 결과로는 연결 고리의 탐색과 예방이 용이하지 않았다. 두 질환을 서로 연결하는 고리를 탐색하여 차단할 수 있다면, 고지혈증에서 고혈압을 거쳐 동맥경화로 빠르게 전이되는 것을 예방할 수 있다. 그러한 실험의 한 예는 고혈압에 의한 고지혈의 상승작용을 Angiotensin II Receptor Blocker (ARB) 처리로 원천 봉쇄한 후, Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) 세포 모델에 고농도 low density lipoprotein (LDL) 처리하여 고지혈증을 유발하는 것이다. 이런 일련의 실험을 거치면 고지혈증에서 동맥경화로 전이되는 과정에서 고혈압의 상승작용 역할을 배제할 수 있다. 고혈압이 고지혈증에서 동맥경화로의 전이에 미치는 영향을 분리하여 관찰한다면, 동맥경화증과 고혈압의 작용기전에 대한 이해와 치료방법의 파악이 용이할 수 있다. 지금까지 동맥경화증을 비롯한 콜레스테롤 대사 이상으로 인한 질병의 예방 및 치료 제재 개발은 대략 콜레스테롤 대사상 특정효소의 역가를 저해하는 방향에서 치열한 경쟁을 벌여왔다. 그러나, 효소활성의 제어를 통한 치료는 작용시간이 매우 한시적이며 부작용 또한 심각한 문제로 대두되고 있다. 본 연구는 유전자 발현을 제어할 수 있는 물질을 탐색함으로서 콜레스테롤 대사 이상 질병의 해결에 근본적으로 접근하고자 한다. 흔히 민간 치료나 음식으로 섭취 가능한 자생식물 등을 이용하므로 약물 부작용 문제를 자연적으로 해결할 수 있을 것이 기대되며 특정 효소의 발현을 제어할 수 있는 물질이 본 연구를 통해 개발된다면 현재까지의 혈중 콜레스테롤 강하제 개발의 개념을 바꾸는 혁신적 성과를 가져올 수 있다. 콜레스테롤 증가, 특히 높은 LDL 콜레스테롤은 죽상동맥경화증과 관련된 질병의 위험요인으로 일반적으로 인정되고 있으며, 그 중에서도 특히 저밀도 지질 단백질 (LDL)이 산화되어 생성된 산화된 저밀도 지질 단백질 (Ox-LDL)이 가장 주요한 발병 요인으로 지적되고 있다. 저밀도 지질 단백질은 혈중 콜레스테롤을 운반하는 단백질 중 하나로서, 이것이 산화되면 본래의 기능을 하지 못하고 혈관 내에서 대식세포 (macrophage)에 의해 작은 거품세포로 변환되는데, 이 거품세포는 혈관 내피세포로 침투되어 평활근을 비후시킨다. 또한 산화된 지질 단백질은 대식세포를 동맥벽에 머무르게 하므로 혈관 내피에 지방선이 형성되고, 이로 인해 동맥경화증이 유발된다. LDL은 지질과 필수아미노산, ApoB, 그리고 산화에 대하여 방어적 기전을 가지고 있는 내인성 항산화제인 α-tocopherol을 포함하는 cholesteryl ester로 구성되어 있다. LDL의 정상기능 중의 하나는 불포화지방산, 지용성비타민, 프로비타민을 간외 조직에 분배하는 것이다. Probucol이나 N,N'-diphenylenediamine과 BHT와 같은 antioxidants은 산화정도를 약화시키고 죽종형성영역을 감소시켰으나 부작용이 따라 사용이 제한되고 있다. 따라서 유기합성 항산화제와 비교하여 “generally recognized as safe(GRAS)"로 평가되는 천연 항산화제의 장점 때문에 최근 들어 유럽 및 미주 지역에서 천연물 유래 약용 및 기능성식품의 중요성이 크게 부각되고 있다. 페놀릭 화합물은 다양한 식물군에 천연물 또는 이차 대사산물 형태로 들어있는데 HIV integrase 억제효과, 항균작용, 소염작용, 항알러지작용 등 여러 가지 생리활성을 나타낸다. 항산화 효능 등 다양한 생리활성을 나타내는 플라보노이드는 생체내에서 더 작은 페놀릭 화합물로 분해되어 히드록시 신남산 혹은 벤조산으로 변하기도 한다. 플라보노이드의 대사물인 히드록시 신남산 및 벤조산이 플라보노이드가 갖는 생리활성과 비슷한 활성을 나타낸다. 리그난 화합물은 여러 가지 식물에 다양한 구조로 존재하는데, 항산화 효과, 항균, 살충효과 등 여러 가지 생리활성을 나타낸다. 히드록시 신남산은 리그난의 생합성과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 플라보노이드의 대사과정과 리그난의 생합성 과정에서 중요한 역할을 하며 항산화 효능이 있는 것으로 확인된 신남산의 구조를 변형시킨 새로운 페놀릭 유도체를 만들어 항산화 효능을 탐색 하고자 한다. 부작용이 적고 동맥경화를 치료 할 수 있는 약제의 개발이 시급한 실정이다. 현재 사용되고 있는 고혈압 및 동맥경화증 치료제는 간독성 등의 부작용이 수반되는 질병 특이적이지 못한 단점이 있다. Knock-out mouse는 생체내 혈압 및 지질대사 등에 중요한 역할을 하는 유전자를 knockout시킨 모델로서 해당유전자의 역할을 정확하게 연구할 수 있고, 새로운 유전자를 검색하는 모델로서 아주 적합하다고 할 수 있다. 따라서 기존의 치료제와는 차별성이 있는 terget molecule을 찾아서 치료제를 개발하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 뇌졸중은 혈액 공급을 받지 못하게 되는 뇌의 조직이 파괴되어 여러 가지 증상을 일으키는 무서운 질병으로 고혈압, 고지혈증에 의한 동맥경화 및 당뇨는 가장 강력한 뇌졸중의 위험요인이다. 따라서 고혈압 모델인 spontaneously hypertensive rat (SHR)에서 뇌졸중에 특이적인 유전자를 발굴하여 고혈압과 뇌졸중에 관련된 유전자의 기전을 연구하려한다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1. 연구개발 목표 고지혈증과 고혈압의 연결고리 및 동맥경화 유전자 탐색 기반기술 확립 2. 연구개발 내용 및 범위 - 쥐의 VSMC 세포를 분리 배양 및 안정화된 세포주 확립 - LDL(d =1.019-1.063) 분리, Ox-LDL 제조 - 동맥경화(고지혈증)와 고혈압의 연결고리 유전자 탐색 - (천연물 또는 합성유도체로부터) LDL-antioxidant 탐색 - CETP, LDLr, LCAT 등 고지혈증 관련 유전자의 발현관측 체계의 확립 - Congenic 마우스의 확립 (대표적인 동맥경화증 마우스인 LDL receptor knock-out 마우스와 고혈압 마우스인 Angiotensinogen duplication 마우스를 유전적인 back-ground가 동일한 C57BL6 마우스로 congenic 마우스를 만듬) - 뇌졸중 관련 유전자의 탐색을 위한 middle cerebral artery occlusion (MCAO) model 확립 Ⅳ. 연구개발 결과 1. 동맥경화(고지혈증)와 고혈압의 연결고리 유전자 탐색 인간 대동맥 연근세포 (aortic smooth muscle cell)를 Clonetics사에서 구입하여 고지혈증 현상과 유사하게 LDL를 처리하는 방법으로, 세포 질환 모델을 설정하였다. LDL과 ARB [Angiotensin receptor blocker, Losartan (Merk)]을 처리한 처리구 VSM과 ARB만 처리한 대조구 VSM를 가지고, 각각을 subtractive hybridization을 수행하였다. 인간 대동맥 연근 세포에 LDL을 처리하였을 때, 전사가 촉진되는 새로운 유전자군과 전사가 감소되는 새로운 유전자군을 발굴하였다. 유전자의 기능이 알려져있는 IL1-R와 PDGFR등 일련의 수용체 관련 유전자의 LDL 반응 관련 기능을 먼저 연구하고, 기능이 알려져 있지 않은 새로운 여러 다른 유전자들은 2차년도에 연구하고자 한다. 2. 콜레스테롤 대사 관련 유전자의 발현관측체계의 확립 및 발현조절 물질 개발을 위한 1차 탐색 시스템 확보 CETP 유전자를 포함한 LCAT, LPL 유전자의 promoter 부위를 확보하고, reporter vector에 cloning하여 탐색 시스템을 구축하였다. 아울러 위 유전자들이 발현되는 liver cell (HepG2)의 배양조건과 transfection condition을 찾는다. 또한 reporter gene의 assay를 통한 promoter 활성정도를 파악하였다. CETP 유전자의 promoter -3.4 kb, LDL receptor 유전자의 promoter -1.5 kb 그리고 LCAT 유전자의 promoter -300 bp를 확보하였다. 그 뒤 이들을 reporter gene으로 luciferase를 가지는 pGL3 basic vector에 cloning하였고, HepG2 cell을 이용 transient transfection하였다. 이들 유전자들의 전사활성은 luciferase assay를 통해 나타내었으며, 5′deletion mutant를 구축하였다. 3. 천연물로부터 LDL-Antioxidant 탐색 경상남도 거창에서 구입한 삼백초의 뿌리로부터 메탄올 추출, 물, 헥산, 크로르포름을 이용한 용매분배 추출한 후, 항산화작용을 측정한 결과 크로르포름층이 활성이 가장 강함을 확인하였다. 크로르포름층을 감압하에서 농축, 건조하여 얻은 흑갈색의 유성물질을 헥산과 에칠아세테이트의 비율을 변화시키면서 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 실시하고, 여기에서 분리한 활성 분획을 C-18 컬럼크로마토그라피, 또 한번의 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 통해 순수 활성물질인 화합물-1 15 mg과 화합물-3 10 mg을 얻었고,. 화합물-1로부터 화합물-2를 합성하였다. GC/MS spectra, 1H, 13C, COSY, HMQC, HMBC, DEPT NMR spectra를 종합적으로 분석하고 발표된 문헌의 data와 비교 분석하여 화합물-1은 Machilin D로, 화합물-2는 Virolin으로, 신규 화합물-3는 Saururin A로 명명하였다. Machilin D, Virolin, Saururin A의 IC50 값은 각각 2.9 μM, 4.3 μM, 8.5 μM이었으며, 농도 의존적으로 LDL-oxidation 활성을 억제하였다. 4. 2, 3-diarylidenebutanedioic acid와 그의 유도체 합성 3,4-dimethoxybenzaldehyde로부터 2,3-bis(3,4-dimethoxybenzylidene) butanedioic acid의 합성법을 확립한 후, 같은 방법으로 piperonal로부터2,3-bis(3,4-methylenedioxybenzylidene)butanedioic acid를 얻을 수 있었다. 합성된 2,3-bis(3,4-dimethoxybenzylidene)butanedioic acid를 모핵으로 하여 6개의 유도체를, 2,3-bis(3,4-methylenedioxybenzylidene)butanedioic acid를 모핵으로 하여 6개의 유도체를 합성하였으며, 각 유도체의 구조는 분광학적 방법으로 확인하였다. 5. Congenic 마우스의 확립 고혈압 연구 모델동물로서 현재 세계적으로 가장 많이 사용되고 있는 안지오텐신 유전자 적중 마우스를 유전체 정보가 가장 많이 확보되어 있는 C57BL6/J 마우스로 congenic화 하는데 성공하였으며, 고혈압의 원인이 되는 동맥경화증을 일으키는 low-density lipoprotein receptor knock out 마우스를 이용하여 동맥경화증과 관련있는 유전자를 발굴하여 그 기능을 분석 중에 있다. 6. MCAO 방법을 이용한 뇌졸중 모델을 확립 뇌졸중에 관련된 유전자의 발굴을 위하여 MCAO 방법을 이용한 뇌졸중 모델을 확립하였다. Ⅴ. 연구개발 결과의 활용계획 현재까지의 연구는 고지혈과 고혈압, 그리고 동맥경화가 각기 다른 배경을 바탕으로 하여 독립적으로 연구되어져 왔다. 하지만 현재의 연구 방향은 유전자의 개별연구가 아닌 유전자의 체계적인 연구로 그 연구의 추세가 바뀌고 있다. 따라서 본 연구의 기대 효과는 고지혈이 동맥경화를 유발하는 시작점에서 체계적으로 변화되는 유전자를 종합적으로 연구할 수 있는 발판을 제공한다고 할 수 있겠다. 이것은 본 연구의 결과물을 이용하여 동맥경화로 진행되는 것을 예방할 수 있는 치료제의 타겟을 발굴할 수 있을 것으로 사료된다. 확보된 CETP, LDL receptor, LCAT promoter를 이용, 발현수준을 조절할 수 있는 물질을 개발하고자 한다. 아울러 LPL, hepatic TG lipase 유전자의 promoter를 이용하여 이들 천연물이 lipid metabolism에 중요한 역할을 수행하는 유전자들의 전사활성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지를 조사할 것이다. 이렇게 개발된 탐색 system은 혈중 콜레스테롤 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 screening하는데 매우 효과적인 tool로 사용되어 질 수 있을 것이다. 또한 개발된 물질들이 동물실험을 통해 안정성 등이 검정되면 단백질 수준이 아닌 유전자 수준의 제어를 통한 콜레스테롤 강하제 시장에도 막대한 영향을 미칠 것이다. 동의보감 등에서 볼 수 있듯이 생약성분함유 약용식물을 이용한 민간요법이 전해지고 있으며, 또한 유럽, 미국 등 서양에서 청정농산물에 관한 관심이 급증하여 천연물을 이용한 건강보조식품의 소비량이 급증하고 있으며, 최근 미국에서는 FDA 및 NIH에서는 한국, 중국 등에서 사용되는 민간약재에 대해 동물실험을 거치지 않고, 직접 미국인에 대한 약효검색을 통해 식물성분 추출액 및 이들 성분의 이용에 관해 공식으로 인정할 움직임이어서 건강유지, 질병예방용 기능성 생물소재시장이 크게 확대될 전망이다. 따라서 본 연구에서는 삼백초로부터 분리한 LDL-antioxidant을 이용하여 성인병중에 큰 비중을 차지하는 심장순환기 질환인 고지혈증 및 동맥경화증에 대한 효능 검증을 통해 고지혈증 및 동맥경화증에 대한 예방 효과를 입증하면, 최근에 국내외로 그 중요성이 부각되고 있는 식품의약(Nutraceuticals) 개발 측면에 파급 효과가 클 것으로 생각된다. 또한 지금까지 알려져 온 것처럼 심장순환기 질환인 고지혈증 및 동맥경화증은 일단 발병하면 완전한 치료는 대단히 어렵다는 점을 감안할 때, 치료보다는 예방에 역점을 두고, 약물 독성이 없으며, 안전하여 장기간 복용이 가능한 식품 원료로부터 생산된 유용물질의 활용 측면에서 대단한 의의가 있다고 판단된다. 2,3-diarylidenebutanedioic acid와 그의 에스테르 유도체들의 탄소수에 따른 구조변화가 활성에 어떤 영향을 미치는지 알 수 있는 생체 활성검정 실험을 하여야 한다. In vitro LDL 항산화 효능검정을 완료한 후에 동물실험을 거쳐 pharmacophore를 분석하고, 선도물질을 찾아내며, 최적화를 통한 동맥경화 치료제의 후보물질을 도출하는데 활용하고자 한다. Congenic화 한 동물 모델은 다른 종류의 모델동물과 cross breeding이 가능하여 고혈압의 원인 유전자를 연구하는데 중요한 infra로 이용 될 수 있다. 본 연구의 결과는 고혈압의 치료 약물에 대한 신약개발에 활용될 수 있을 것이며, 특히 모델동물들은 동물자체가 특허와 연결되어 산업적인 가치를 지닐 뿐만 아니라 새로움 개념의 유전체 신약개발에 활용이 가능할 것이다. 따라서 본 연구는 이제 새로운 개념의 연구를 시작하는 기반을 마련한 것으로서 이들 모델을 이용한 신 개념의 신약개발을 위한 계속적인 연구가 필요하다. MCAO model을 확립하였으므로 high cholesterol 먹이로 고지혈증을 유발시킨 쥐와 고혈압 model 쥐에서 stroke에 의하여 유발되는 유전자의 비교분석 및 분리 동정 실험이 요구된다. 이는 고혈압, 고지혈, 뇌졸중을 하나의 연관된 질환으로 생각하는 최근의 연구추세에 적합한 방법으로 사료된다.
