초록 ▼

고지혈증 치료의 주요한 목표는 동맥경화성 질환의 예방과 치료이며 고지혈증에 대한 약물요법을 효율적으로 진행하기 위해서는 섭취칼로리의 제한이나 적정한 체중의 유지 등과 같은 적절한 생활 style을 유지하는 것이 가장 기본이다. 현재 고지혈증을 개선시킬 수 있는 합성의약품이 많이 개발되어 높은 유용성이 인정되고 있으나 치명적인 부작용이 발현됨에 따라 새로운 치료약물의 개발이 요구되고 있어 비교적 안전성이 있고 오랜 경험적 축적에 의하여 사용되고 있는 한방약물로부터 고지혈증 치료약물의 개발을 시도하였다.
한의학에서 고지혈증과

고지혈증 치료의 주요한 목표는 동맥경화성 질환의 예방과 치료이며 고지혈증에 대한 약물요법을 효율적으로 진행하기 위해서는 섭취칼로리의 제한이나 적정한 체중의 유지 등과 같은 적절한 생활 style을 유지하는 것이 가장 기본이다. 현재 고지혈증을 개선시킬 수 있는 합성의약품이 많이 개발되어 높은 유용성이 인정되고 있으나 치명적인 부작용이 발현됨에 따라 새로운 치료약물의 개발이 요구되고 있어 비교적 안전성이 있고 오랜 경험적 축적에 의하여 사용되고 있는 한방약물로부터 고지혈증 치료약물의 개발을 시도하였다.
한의학에서 고지혈증과 관련이 있는 질환이라 할 수 있는 것은 협심증과 같은 心痛이나 胸痛이다. 특히, 협심증이란 허혈성 심장질환의 범주에 속하며 한의학에서는 胸痺의 범주에 속하며 오늘날에 와서는 心絞痛이라 하여 치료법 개발에 많은 관심이 집중되어 있고 이러한 질환은 현대의학에서 동맥경화증, 관상동맥질환 등과 같은 고지혈증과 밀접한 관련이 있는 것으로 생각되어 고지혈증과 한의학적 변증시치와의 관련성을 파악하고 이 증에 활용되는 치법, 방제 등을 조사하여 약 50여종의 한약재를 선정하여 고지혈증 한방치료약물 개발을 위한 시료로 사용하였다.
우선 길경, 황금 등 50여종의 한약재를 선정하여 in vitro에서 HMG-CoA reductase 저해활성과 free radical인 DPPH 항산화활성 등을 지표로 하여 항고지혈증 활성을 보인 약물로 현호색, 지실, 지각, 황금, 적작약, 당귀, 목단피, 죽여, 계지, 산사 등 10여종에서 강한 활성을 보였다. 그리고, 이들 약물 중에서 황금 등 7종 약물을 선정하여 in vivo에서 Triton WR-1339 처치로 유발된 고지혈증 병태모델 흰쥐, 고 cholesterol 식이 처치로 유발된 고지혈증 병태모델 생쥐 및 corn oil 처치로 유발된 고지혈증 흰쥐에 경구투여하여 황금, 당귀, 죽여, 계지에서 cholesterol, triglyceride 등 혈청 parameter의 유의성이 있는 변화가 인정되어 이들 약물은 항고지혈증 효과가 있음을 알 수 있었다.
한방방제 중에서 흉통 등에 활용되는 방제로 과루해백백주탕, 과루해백반하탕, 지실해백계지탕을 합방하고 여기에 1차 screening을 통하여 유효한 약물로 선정된 수종의 한약재를 각각 조합하여 in vitro에서 HMG-CoA reductase 저해활성, DPPH free radical scavenger 효과, 지질과산화 형성저해효과 및 LDL 항산화효과와 in vivo에서 Triton WR-1339 처치 고지혈증 병태모델 흰쥐, 30% corn oil 처치 고지혈증 병태모델 및고cholesterol 식이 처치로 유발된 고지혈증 생쥐에 혈청 및 간 중의 지질함량 변동을 지표로 하여 평가한바 가장 유효한 방제로 가미과루해백황금탕을 도출할 수 있었다. 가미과루해백황금탕은 과루실 24g, 해백 9g, 재실 24g, 반하 12g, 후박 12g, 계지 12g 및 황금 6g으로 구성되어 있다.
한편 가미과루해백황금탕 구성약물 중에서 가장 유효한 HMG-CoA reductase 저해활성을 보인 지실의 $CH_2Cl_2$ 분획으로부터 활성물질을 분리하여 3′,4′,5,6,7,8-hexamethoxyflavone(nobiletin)와 3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavanone(hesperetin)을 각각 동정하였다. 그리고 이들 화합물의 HMG-CoA reductase에 대한 저해활성을 $IC_{50}$로 나타내면 각각 0.016mg/ml와 0.138mg/ml로강한 저해활성이 인정되었다.
그리고, 가미과루해백황금탕의 약용량이 비교적 적고 보다 유용성이 높은 고지혈증 치료한방약물을 얻고자 하는 연구의 일환으로 가미과루해백황금탕을 bioassay directed fractionation하여 얻은 n-BuOH 분획물과 개개 구성약물 중에서 가장 양호한 활성을 보인 분획물만을 조합한 검체를 각각 이용하여 in vitro 및 in vivo에서 항고지혈증 활성을 검색한 바 비교적 개개 구성약물의 활성이 양호한 분획물의 조합이 보다 유효한항고지혈증 효과가 인정되고, 특히 투여용량을 고려하였을 경우 보다 유용성이 높은 것으로 사료된다.
고지혈증 한방치료약물 개발 중에서 한의약품의 제형개변을 위한 연구를 위한 방제로 앞서의 연구를 통하여 도출된 고지혈증에 유효한 한방처방으로 가미과루해백황금탕을 선정하여 이 처방의 품질관리방안, 정제로의 제형개변을 시도하여 양호하게 정제로의 제형개변을 할 수 있었다.
품질관리방안으로 가미과루해백황금탕 구성약물 중 해백 중의 β-sitosterol, 지실 중 hesperidin, 후박 중 magnolol 및 honokiol, 황금 중baicalin, 계지 중 cinnamaldehyde 및 cinnamic acid, 반하 중 guanosine을 지표물질로 하여 품질관리를 행할 수 있었다. 그리고, 이들 지표물질을 가미과루해백황금탕 중에서도 정량이 가능하였다.
또한, 가미과루해백황금탕을 정제로 제형개변하기 위하여 부형제로 lactose와 avicel, 결합제로 hydroxypropylcellulose, film coating 기제로 hydroxypropylmethycellulose, 착색제로 산화티탄을 사용하여 백색의 film coating 정제로 만들 수 있었다. 이 정제의 안정성을 검토하기 위하여 가혹상태에서 경도, 붕해도, 흡습도 및 각 구성약물의 지표성분 hesperidin, magnolol, honokiol, baicalin, cinnamic acid 등의 안정성을 지표로 하여 평가한 바 가미과루해백황금탕 정제에 있어서 나정에 비하여 film coating 정이 비교적 안정한 것으로 사료되며 이는 가미과루해백황금탕이 다성분계로 되어 있으므로 hydroxypropylmethylcellulose 등 film coating agent에 의하여 흡습을 방지하거나 차광 등 외기의 노출로부터 보호할 수 있기 때문에 저장 중 수분에 의하여 분해되거나 휘산되는 것을 억제시키는 것에 기인하는 것으로 사료된다.
가미과루해백황금탕 정제는 방제 구성약물의 80% 에탄올 추출물의 조합으로 되어 있어 기존의 제형(탕제)과의 생물학적, 화학적, 약효학적 동등성을 평가하여 유용성을 확보하고자 하였다. 그 결과 in vitro에서 HMG-CoA reductase 저해활성, DPPH free radical scavenging 효과 및 지질 과산화형성 억제효과와 in vivo에서 Triton WR-1339 및 corn oil 처치로 유발된 고지혈증 병태모델 흰쥐와 고 cholesterol 식이 처치로 유발된 고지혈증 병태모델 생쥐에서 전반적으로 가미과루해백황금탕 정제 처치군이 비교적 양호한 항고지혈증 효과가 인정되었다.
그리고, 생물학적 동등성을 평가하기 위하여 in situ 관류법을 이용하여 흰쥐 소장에서 구성약물의 지표성분 흡수율을 검토한바 두 검체 사이에는 비교적 유사한 흡수율이 인정되었다. 반면에 흰쥐에 가미과루해백황금탕을 경구투여하고 naringin 및 baicalin 혈중농도를 지표로 평가한 바두 검체 사이에는 유의한 차이가 인정되어 계속 추구하고자 한다.
가미과루해백황금탕 정제의 안전성을 평가하기 위하여 1회 경구투여 급성독성 및 4주간 연속 경구투여 아급성 독성을 각각 암수 생쥐 및 흰쥐에서 검토한 바 시험물질에 기인하는 이상을 관찰할 수 없었고 생쥐에서 $LD_{50}$은 5,000mg/kg 이상, 흰쥐에서 무해용량은2.0g/kg 이상으로 추정되어 안전함을 알 수 있었다.
결론적으로 방제학적 측면과 in vitro 및 in vivo에서 현대과학적으로 고지혈증 치료약물 개발을 위한 screening법을 이용하여 고지혈증에 유효한 한방치료약물의 하나로 가미과루해백황금탕을 개발하였으며, 이 방제는 과루실, 해백, 지실, 반하, 후박, 계지, 황금으로 구성되어 있다. 앞으로 가미과루해백황금탕의 유용성을 계속 검토하여 임상에 활용할 수 있는 자료로 제공하고자 한다. 또한, 이러한 실험결과를 바탕으로 하여 앞으로 고지혈증 치료 한방약물의 개발에 있어서 새로운 제형으로 개변하기 위한 기반기술에 기여할 뿐만 아니라 유용성이 높은 고지혈증 한방치료약물개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Fifty oriental herbal medicines including Platycodi Radix and Scutellariae Radix, etc., which have been used for the cure ofhyperlipidemia and coronary heart disease were evaluated for the HMG-CoA reductase inhibition and antioxidant effect on free radical, DPPH in vitro, and antihyperlipidemic effe

Fifty oriental herbal medicines including Platycodi Radix and Scutellariae Radix, etc., which have been used for the cure ofhyperlipidemia and coronary heart disease were evaluated for the HMG-CoA reductase inhibition and antioxidant effect on free radical, DPPH in vitro, and antihyperlipidemic effect on hyperlipidemic rats induced by Triton WR-1339, 30% corn oil and highcholesterol diet in vivo. Among them, 80% MeOH extract of Scutellariae Radix(SR), Angelicae Gigantis Radix(AGR), Bambusae Caulis in Taeniam(BCT) and Cinnamomi Ramulus(CR) showed effective antihyperlipidemic action against experimentalhyperlipidemic animal models. Then, in order to search new antihyperlipidemic agents from the oriental medicinalherbs, we chose SR, AGR, CR and BCT which have the significant antihyperlipidemic effect in vitro and in vito, and those herbs were systematically fractionated with organic solvent. EtOAc fraction of SR, hexane fraction of BCT, AGR and chloroform fraction of CR exhibited remarkabe inhibitory effect on HMG-CoA reductase activity.
Also, we have found that several herbal medicines including Trichosanthis Fructus(TC), Pinelliae Tuber(PT), Aurantii Immaturus Fructus(AF), Magnoliae Cortex(MC), Allii Macrostemi Bulbus(AB), CR, SR, Corydalis Tuber(CT), Crataegi Fructus(CF)exhibited antihyperlipidemic effects. Therefore, some herbal prescriptions which are formulated with those herbs havebeen evaluated for inhibitory activities on HMG-CoA reductase, lipid peroxidation of rat liver homogenate, LDL oxidation, andDPPH free radical scavenging activity in vitro. Among them, 80% extract of Gamigwaruhaebaekbaekju-Tand(GGHBT),Gagamgwaruhaebaekbaekju-Tang(GGGHBT) and Gamigwaruhaebaekhwanggum-Tang(GGHWT) showed remarkably inhibitory effects on HMG-CoA reductase, lipid peroxidation of rat liver, LDL oxidation, and DPPH free radical scavenging effect in a dose-dependent manner. Especially, GGHWT which is formulated with TC, PT, AF, MC, AB, CR and SR on the basis of Gwaruhaebaekbaekju-Tang listed on the traditional medicinal references showed more effective hypocholesterolemic activities in vitro bioassay than the other prescriptions. Also, GGHWT which is composed of TC 24g, MC 9g, AF 24g PT 12g, MC 12g, CR 12g and SR 6g significantly inhibited the increase ofserum and liver lipid levels inexperimental hyperlipidemic animal models.
And then, in order to isolate the antihyperlipidemic active constituents from the oriental herbal medicines, the bioassay-directedfractionation of 80% ethanol extract of AF yielded two active constituents responsible for the inhibition on theHMG-CoA reductase in vitro. They were identified by spectral evidences as 3′,4′,5,6,7,8-hexamethoxyflavone(nobiletin) and 3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxy flavanone(hesperetin), respectively. Both of them were observed to exhibit a significant inhibition on theHMG-CoA reductase with dose-dependently manner.
To develop the usage methodology of oriental herbal medicines, we have conducted the bioassay-directed fractionation of GGHWT with hexane, chloroform, ethylacetate and n-butanol successively. Formulation of active organic fraction of each herbcomprised GGHWT exhibited more antihyperlipidemic effects than other formulation of GGHWT in vitro and in vivo.

목차 Contents

• I. 연구개발결과 요약문...7
• (한글)...7
• (영문)...9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...11
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...13
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...16
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...20
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...28
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...33
• 6. 첨부서류...36
• III. 제 1세부연구개발과제 연구결과...69
• 1. 제 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...71
• 2. 제 1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...73
• 1) 1차 연도 연구대상 및 방법...73
• 가) 고지혈증에 유효한 한방처방 및 약재의 선정...73
• 나) 고지혈증에 관한 한의학적 병태와 증의 분석...73
• 다) 시료의 수집 및 조제...73
• 라) In vitro에서 cholesterol 생합성 저해활성 검색법의 확립...73
• 마) 저해물질의 특성연구...74
• 2) 2차 연도 연구대상 및 방법...75
• 가) 시료의 수집 및 검액의 조제...75
• 나) 시약 및 기구...75
• 다) 실험동물...76
• 라) In vitro에서 cholesterol 생합성 저해활성 저해물질의 검색...76
• 마) DPPH 항산화 활성검색...77
• 바) 과산화지질 형성 저해활성 검색...77
• 사) Low density lipoprotein(LDL) 항산화 작용...77
• 아) 고지혈증에 대한 작용...78
• 자) $CCl_4$ 간독성 유발 흰쥐에 미치는 영향...78
• 차) 간 균질화 및 세포 소긴관의 분리...79
• 카) 혈청 분리 및 간 중의 지질추출...79
• 타) 혈청 및 간 중 지질 및 효소활성 측정...79
• 파) 통계학적 분석...81
• 3) 3차 연도 연구대상 및 방법...85
• 가) 실험재료...85
• 나) 시료의 조제 및 분획...85
• 다) 시약 및 기구...85
• 라) 실험동물...86
• 마) 지실로부터 유효성분의 분리...86
• 바) In vitro에서 저해활성 검색...86
• 사) Triton WR-1339 투여 유발 고지혈증 흰쥐에 미치는 영향...86
• 아) 30% Corn oil 유발 고지혈증 흰쥐에 미치는 영향...87
• 자) 고 cholesterol 식이 유발 고지혈증 생쥐에 미치는 영향...87
• 차) 혈청 분리 및 간 중의 지질성분 측정...87
• 카) 통계학적 분석...88
• 3. 제 1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...90
• 1) 1차 연도 연구개발결과...90
• 가) 고지혈증 한방치료의 병인병리와 치료에 관한 문헌조사...90
• 나) 고지혈증과 연계한 한의학적 병태와 증의 분류...91
• 다) 한의학에서 고지혈증에 사용되는 방제 및 구성약물의 조사...92
• 라) 약물의 선정...94
• 마) 흰쥐 HMG-CoA reductase의 분리 및 한약의 활성저해 효과...95
• 바) 유효성분의 분획...95
• 2) 2차 연도 연구개발결과...100
• 가) HMG-CoA reductase 저해효과...100
• 나) DPPH 항산화 효과...101
• 다) 지질과산화 형성억제효과...101
• 라) Low density lipoprotein(LDL) 산화 억제효과...102
• 마) Triton WR-1339 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...103
• 바) 30% Corn oil 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...104
• 사) 고 cholesterol 식이 유발 고지혈증 생쥐에서 항고지혈증 효과...104
• 아) 사염화탄소 간장해에 대한 보??) 지실 및 황금 유기용매 분획물의 in vitro에서 HMG-CoA reductase 저해효과, DPPH 항산화효과 및 지질과산화 형성억제효과...124
• 나) 지실로부터 활성물질의 분리...124
• 다) 가미과루해백황금탕 유기용매 분획물이 in vitro에서 HMG-CoA reductase 저해효과, DPPH 항산화효과 및 지질과산화 형성저해효과...125
• 라) Triton WR-1339 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...126
• 마) 30% Corn oil 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...128
• 바) 고 cholesterol 식이 유발 고지혈증 생쥐에서 항고지혈증 효과...128
• 4. 제 1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...143
• 5. 제 1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...154
• 6. 제 1세부연구개발과제의 활용계획...156
• 7. 참고문헌...158
• IV. 제 2세부연구개발과제 연구결과...163
• 1. 제 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...165
• 2. 제 2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...167
• 1) 1차 연도 연구대상 및 방법...167
• 가) 시료의 채집 및 동정...167
• 나) 표준시료 엑스의 조제...167
• 다) 표준시료의 유기용매 분획물의 제조...167
• 라) 시약 및 기구...167
• 마) 실험동물...168
• 바) In vitro에서 cholesterol 생합성 저해활성 저해물질의 검색...168
• 사) DPPH 항산화 활성검색...168
• 아) In vivo에서 고지혈증 병태모델 동물에 미치는 영향...169
• 자) 통계학적 분석...171
• 2) 2차 연도 연구대상 및 방법...175
• 가) 시료의 수집 및 검액의 조제...175
• 나) 검액의 조제...175
• 다) 시약 및 기구...175
• 라) 실험동물...176
• 마) 시료의 표준화...176
• 바) 가미과루해백황금탕 정제의 타정 및 안전성 시험...179
• 사) 가미과루해백황금탕 정제의 급성독성 시험...182
• 아) 통계학적 분석...184
• 3) 3차 연도 연구대상 및 방법...185
• 가) 실험재료...185
• 나) 시료의 조제...185
• 다) 시약 및 기구...185
• 라) 실험동물...186
• 마) In vitro에서 저해활성의 검색...186
• 바) In vivo에서 고지혈증 병태모델 동물에 미치는 영향...186
• 사) In situ 관류법을 이용한 흰쥐 소장에서 지표성분 흡수에 미치는 영향...187
• 아) 흰쥐에서 가미과루해백황금탕 지표성분 naringin 및 baicalin 혈중농도에 미치는 영향...188
• 자) 유부분배계수 측정...189
• 차) 아급성 독성시험...189
• 카) 통계학적 분석...191
• 3. 제 2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...192
• 1) 1차 연도 연구개발결과...192
• 가) In vitro에서 cholesterol 생합성 저해효과와 DPPH 항산화 효과...192
• 나) Triton WR-1339 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...193
• 다) 고 cholesterol 식이 유발 고지혈증 생쥐에서 항고지혈증 교화...193
• 라) Corn oil 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈 효과...194
• 마) 황금, 당귀, 죽여 및 계지의 유기용매 분획물의 HMG-CoA reductase 저해효과...194
• 2) 2차 연도 연구개발결과...203
• 가) 가미과루해백황금탕 및 구성약물의 품질표준화...203
• 나) 가미과루해백황금탕 정제의 타정 및 안정성 평가...205
• 다) 급성독성...209
• 3) 3차 연도 연구개발결과...239
• 가) In vitro에서 HMG-CoA reductase 저해활성 및 항산화 활성...239
• 나) Triton WR-1339 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈증 효과...239
• 다) Corn oil 유발 고지혈증 흰쥐에서 항고지혈 효과...240
• 라) 고 cholesterol 식이 유발 고지혈증 생쥐에서 항고지혈증 효과...241
• 마) In situ 관류법을 이용한 흰쥐 소장에서 가미과루해백황금탕 지표성분 흡수효과...242
• 바) 흰쥐에서 가미과루해백황금탕 지표성분 naringin 및 baicalin의 혈중농도...243
• 사) 가미과루해백황금탕 지표성분 naringin 및 baicalin의 유수분배계수 비교...245
• 아) 아급성 독성...245
• 4. 제 2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...275
• 5. 제 2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...289
• 6. 제 2세부연구개발과제의 활용계획...291
• 7. 참고문헌...293