초록 ▼

1990년도 기본연구 과제에서는 균주를 분양받아서 Taq polymerase를 정제하여 기존 Taq polymerase와 비교 검토하였다. 1991년도 기본 연구 과제에서는 대량생산을 위한 다음과 같은 연구를 수행하였다.가) 균체 배양 및 염색체 DNA 분리Thermus aquticus YT-1 균주를 70℃, 24시간 진탕 배양하여, 균체를 회수한 후, 염색체 DNA를 분리하였다.나) Taq polymerase(Taq Pol) 유전자의 선별 및 대장균에 cloning기존에 밝혀진 Taq polymerase의 DNA 서열을 바탕으로

1990년도 기본연구 과제에서는 균주를 분양받아서 Taq polymerase를 정제하여 기존 Taq polymerase와 비교 검토하였다. 1991년도 기본 연구 과제에서는 대량생산을 위한 다음과 같은 연구를 수행하였다.가) 균체 배양 및 염색체 DNA 분리Thermus aquticus YT-1 균주를 70℃, 24시간 진탕 배양하여, 균체를 회수한 후, 염색체 DNA를 분리하였다.나) Taq polymerase(Taq Pol) 유전자의 선별 및 대장균에 cloning기존에 밝혀진 Taq polymerase의 DNA 서열을 바탕으로 27-35 mer 정도의 상보적인 oligo DNA 6개를 합성하였다. 이 oligo DNA를 primer로 이용하여 PCR 방법으로 Taq polymerase 유전자의 5´영역의 전반부 및 중간부분을 증폭하여 대장균에 각각 cloning하였다. 또 Taq polymerase 유전자의 3´영역의 후반부는 위의 oligo DNA를 probe로 이용하여 hybridization 방법으로 선별하여 대장균에 cloning하였다.다) Taq polymerase 유전자의 대장균에서의 대량 발현대장균에 각각 cloning된 Taq polymerase 유전자의 3개의 영역을 다시 분리하여, tac promoter를 이용한 발현 벡터에 삽입하여 완전한 Taq polymerase 유전자를 재구성하였다. IPTG 첨가에 의해 발현을 유도한 후, 균체를 회수하여 polymerase 활성을 측정한 결과, Thermus aquaticus YT-1 균체가 생산하는 효소 활성의 수배 이상의 활성을 검출하였다. 또 Taq polymerase의 개시코돈과 SD sequence 사이의 거리를 17bp에서 10bp로 단축한 결과 효소활성이 14배 이상 증가되었다.라) Taq polymerase의 대장균에서의 정제적당한 배양시점에서 IPTG 첨가에 의해 Taq polymerase를 유도시킨 후, 균체를 회수하여 sonicator로 균체를 파쇄하였다. 원심분리에 의해 상층액을 회수한 후, 74℃에서 30분, 열처리하여 대장균 유래의 단백질을 거의 제거하고, FPLC에 의해 정제하였다.

Abstract ▼

Taq DNA polymerase has been shown to be highly useful in the polymerase chain reaction(PCR) method of amplifying DNA fragments. The Taq polymerase gene from Thermus aquaticus YT-1 was cloned in Escherichia coli, in which the gene was obtained through PCR and hybridization methods. To synthesise Taq

Taq DNA polymerase has been shown to be highly useful in the polymerase chain reaction(PCR) method of amplifying DNA fragments. The Taq polymerase gene from Thermus aquaticus YT-1 was cloned in Escherichia coli, in which the gene was obtained through PCR and hybridization methods. To synthesise Taq polymerase in E. coli, We chose the expression vector for the taq polymerase gene, plamid pKTPOL17, was constructed, in which comprised the replication origin of the plasmid from pUC18, the lac $l^q$ gene from pMJR1560. Plasmid pKTPOL17 was transformed into E. coli MV1184, and then the gene expression in pKTPOL17 was induced by the addition of an inducer, IPTG. Using pKTPOL17, the expression of Taq polymerase gene(Taq Pol gene) was shown to low expression level. Consequently, we adjusted the length of a spacer nuciotides to 10 base pairs of translation initiation region by PCR method using the primers, and then plasmid pKTPOL10 was constructed. pKTPOL10 is identical to pKTPOL17 except reducing the length of spacer nucleotides. We have detected the level expression of Taq Pol gene in E. coli containing pKTPOL10. The yield of expression from E. coli harboring pKTPOL10 was at least 14-fold higher than that of the natural Taq polymerase from Thermus aquaticus YT-1.

목차 Contents

• 제1장 서론...15
• 제2장 실험재료 및 방법...17
• 1. 실험재료...17
• 2. 제한효소 및 수식효소...17
• 3. 대장균과 배양조건...17
• 4. Oligo DNA 합성, 정제 및 방사선 동위원소 표지...18
• 5. Thermus aquaticus YT-1의 염색체 DNA 추출...19
• 6. Polymerase chain reaction (PCR) 방법...19
• 7. 알카리 용균법에 의한 Plasmid DNA의 분리...20
• 8. 저융점 agarose gel로부터 DNA 단편 회수...21
• 9. Ligation 및 Transformatiom...22
• 10. 건조 agarose 막 hybridization...22
• 11. Colony hybridization...23
• 12. DNA polymerase 활성 측정...24
• 13. 단백질의 발현 유도...24
• 14. 대장균에서 발현된 Taq Polymerase의 정제...25
• 15. Polyacrylamide gel electrophoresis...25
• 제3장 결과 및 고찰...27
• 1. Oligo DNA의 제조...27
• 2. PCR 방법에 의한 Taq Pol 유전자의 5' 영역 cloning...30
• 3. Hybridization에 의한 Taq Pol 유전자의 3' 영역 cloning...33
• 4. 발현 벡터 내의 완전한 Taq Pol 유전자의 구축 및 발현...36
• 5. Spacer nucleotides 단축에 의한 고발현 유도...44
• 제4장 결론...50