초록 ▼

1. 최종목표
내열성 DNA 중합효소 유전자를 함유한 비대장균성 미생물 균주를 최적화된 발효조 운전조건에서 대량배양하여 얻은 균체로부터 내열성 DNA 중합효소를 정제하는 공정을 단순화하여 비활성이 200kunit/mg이며, PCR 수행시 대장균 유래 DNA가 증폭산물로 검출되지 않고 그 생산원가가 1,000 unit당 400원 이하 수준인 효소 시제품을 개발하고자 함.
2. 개발내용 및 결과
■ 재조합 플라스미드제조
-X. campestris에서 외래 유전자의 발현율을 높일 수 있는 promoter 활성을 갖는

1. 최종목표
내열성 DNA 중합효소 유전자를 함유한 비대장균성 미생물 균주를 최적화된 발효조 운전조건에서 대량배양하여 얻은 균체로부터 내열성 DNA 중합효소를 정제하는 공정을 단순화하여 비활성이 200kunit/mg이며, PCR 수행시 대장균 유래 DNA가 증폭산물로 검출되지 않고 그 생산원가가 1,000 unit당 400원 이하 수준인 효소 시제품을 개발하고자 함.
2. 개발내용 및 결과
■ 재조합 플라스미드제조
-X. campestris에서 외래 유전자의 발현율을 높일 수 있는 promoter 활성을 갖는 단편을 확보하고 서열을 분석함으로써 외래유전자의 항시적 발현용 vector로 pRK415SP를 제조함.
-발현용 vector pRK415SP의 EcoRI 위치에 Taq DNA polymerase 유전자를 도입하여 비대장균성 숙주균인 X. campestris에서 효소 생산용 재조합 플라스미드 pRKTQ7을 최종적으로 제조함.
■ 비대장균성 재조합 균주제조
-X. campestris를 숙주균으로 사용하기 위해 xanthan gum 합성과 관련된 유전자 gumD의 기능을 결손시킨 변이주 X. campestris GD를 제조함.
-X. campestris GD을 Taq DNA polymerase를 함유한 pRKTQ7로 형질전환하여 비대장균성 재조합 균주 X. campestris (pRKTQ7)를 제조함.
■ 재조합 미생물의 효소 생산조건 확립
-재조합 균주의 효소 생산성을 높이기 위해 플라스크 배양을 통해 균의 성장에 적합한 배지조성 확립하고, 발효조를 이용한 배양조건을 최적화함.
-30리터 발효배양을 통해 배양액 1리터 기준으로 900 kU 이상의 Taq DNA polymerase 생산성을 확보함.
■ 시제품 제조와 성능분석
-X. campestris (pRKTQ7)의 배양균체로부터 Taq DNA polymerase의 정제공정을 확립하고 효소활성
5 U/㎕의 시제품을 제작함.
-개발된 Taq DNA polymerase 효소액에 대장균 유래 오염 DNA가 검출되지 않았고, 핵산가수분해 활성도 없는 것으로 확인됨.
3. 사업성과
? 기술적 성과
-비대장균성 숙주인 X. campestris에서 Taq DNA polymerase를 항시적으로 발현 생산함으로써 효소 생산성이 높은 균주를 개발함.
-재조합 균주를 이용한 효소 생산공정이 3 리터에서 30리터 규모의 배양이 가능한 수준으로 확립 되어 생산업체의 상황과 시장수요에 대처하여 효소 생산이 가능하도록 함.
-재조합 숙주균과 유전자조작용 벡터는 에 다른 PCR용 DNA polymerase나 DNA 수식효소의 생산에도 활용가능성이 있다.
-발효공정 1일, 정제공정 4일, 제품제작 1일, 품질검사 1일을 기준으로 볼때 7일 작업일을 기준으로 30 리터 규모로 배양된 균체에서 효소 제품의 제조가 가능함.
? 경제적 성과
-재조합 균주의 배지조성과 배양조건을 최적화함으로써 균체 생산성을 높여 발효조를 이용한 배양시 배양규모를 30 리터로 하였을 때 배양액 1리더 기준으로 900 kUnit 이상의 Taq DNA polymerase의 생산이 가능하였으며, 생산단가는 배지원가, 발효조 운전비용, 정제과정에 소요되는 컬럼수지 (재활용 가능), 소요시약을 기준으로 할 때 <350원/kU에 해당하여 개발제품의 가격 경쟁력을 확보함.
-재조합 대장균을 이용하여 생산하는 경우 유전자 발현을 위해 유도제를 사용하거나, 온도를 변화시켜야 하는 등의 문제점이 있는데, 개발된 비대장균성 균주를 사용할 경우 항시적 발현이 가능하므로 Taq DNA polymerse 유전자 발현을 위해 추가적으로 소요되는 경비나 공정이 없음.
? 사회적 성과(일자리 창출 등)
-비대장균성 재조합 균주로부터 분리 정제한 Taq DNA polymerase 효소시제품에 대장균의 오염 DNA가 검출되지 않으므로 인축의 질병균 진단이나 식중독균의 진단등 보건위생 분야에 활용가능성이 높음.
-본 과제에 참여한 연구조원 학생 중 대학원생 2명과 학부생 1명은 DNA 조작과 효소정제등 바이오산업의 핵심기술과 지식을 습득할 수 있었으며, 또한 참여기업에 방문하여 기업체 연구원과 함께 연구를 수행한 경험이 있어 취업과 산업체 현장에서 역량발휘에 큰 도움이 될 것임.
4. 향후추진계획
?본 연구를 통해 개발된 비대장균성 숙주로부터 생산 정제한 효소의 진단관련 시장진출을 위해 시제품을 사용하여 질병균이나 식중독균을 판정하는데 있어서 기존의 효소제품과 비교되는 자료를 구축하는 실험을 나노헬릭스와 함께 실시할 예정임.
?일반 PCR 반응에도 사용될 수 있으면서도 인축의 질병 및 위생분석 분야에서 PCR 진단 효소로 특화할 수 있도록 용도개발에 추가연구를 수행하기로 참여기업과 협의되었음.

목차 Contents

• 사업비사용실적보고서...1
• 개발결과의견서...8
• 최종보고요약서(초록)...9
• 목차...11
• 제 1 장 서론...12
• 제 1 절 내열성 DNA 중합효소...12
• 제 2 절 내열성 DNA 중합효소의 시장현황...13
• 제 3 절 내열성 DNA 중합효소의 활용과 개량...14
• 제 2 장 과제개발 내용 및 방법...16
• 제 1 절 내열성 DNA 중합효소 유전자 함유 재조합플라스미드 제조...16
• 제 2 절 비대장균성 재조합 균주제조...17
• 제 3 절 재조합 미생물의 효소 생산조건 확립...18
• 제 4 절 시제품 제조와 성능분석...19
• 제 3 장 사업성과...20
• 제 1 절 기술적 성과...20
• 제 2 절 경제적 성과...47
• 제 3 절 기타 성과...48
• 제 4 장 결론...49
• 제 1 절 Taq DNA polymerase 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 제조...49
• 제 2 절 Taq DNA polymerase 유전자를 함유한 비대장균성 재조합 균주제조...49
• 제 3 절 X. campestris (pRKTQ7)를 이용한 Taq DNA polymerase 생산조건 확립...49
• 제 4 절 내열성 DNA polymerase 시제품 개발과 성능 분석...50
• 제 5 절 향후 계획...50