세포사멸 조절물질 개발연구;세포의 노화 및 사멸에 관여하는 caspase 활성 조절물질의 탐색 Discovery and Development of Bio-molecules Modulating Cell Death
보고서 정보
주관연구기관
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2000-01
주관부처
국무조정실 The Office for Government Policy Coordination
등록번호
TRKO200200051033
DB 구축일자
2013-04-18
초록▼
Ⅰ. 제 목 세포의 노화 및 사멸에 관여하는 caspase 활성 조절물질의 탐색 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 최근에 잘못 조절된 apoptosis가 cerebral ischemia, Huntington' disease, Alzheimer, amyotrophic lateral sclerosis 및 Parkinson과 같은 신경학적인 비정상 상태와 관련이 있는 것으로 나타나 apoptosis 관련된 protease의 활성을 조절할 수 있는 물질의 탐색은 상기의 질병을 치료할 수 있는 치료제의 개발에 이용될 수 있을 것이
Ⅰ. 제 목 세포의 노화 및 사멸에 관여하는 caspase 활성 조절물질의 탐색 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 최근에 잘못 조절된 apoptosis가 cerebral ischemia, Huntington' disease, Alzheimer, amyotrophic lateral sclerosis 및 Parkinson과 같은 신경학적인 비정상 상태와 관련이 있는 것으로 나타나 apoptosis 관련된 protease의 활성을 조절할 수 있는 물질의 탐색은 상기의 질병을 치료할 수 있는 치료제의 개발에 이용될 수 있을 것이다. 쥐의 일과성 뇌허혈모델에서 허혈후 수시간에 해마추체세포등에서 caspase family의 caspase 2의 발현량이 증가하며 또 마우스의 동허혈모델에서 허혈후 뇌손상이ZVAD-FMK, YVAD-CMK나 DEVD-FMK같은 caspase저해제의 뇌실내투여에 의해 경감되는 것으로 알려져 있고 ZVAD-FMK는 AMPA나 NMDA에 의한 흥분성뇌손상도 억제한다. 이들 실험적 뇌상해는 인터루킨1β가 직접적인 원인일 가능성도 시사하고 있지만 적게나마 caspase저해제의 임상응용 가능성을 나타내는 결과이다. 인간의 LGL백혈병이나 NK임파종은 혈중의 가용성 Fas ligand의 과잉분비현상이 나타나는데 과잉분비현상이 이들 질환의 제 증상의 원인으로 되어 있고 Fas에 의한 세포사시그날은 중간에 caspase cascade가 관여하고 있어 이들 질환의 치료에도 caspase저해제는 유효할 것으로 생각된다. 만성관절류마티스의 모델인 콜라겐유도성관절염은 IL-1β의 분비과다가 직접적인 원인인 것으로 생각 되고 있지만 caspase저해제에 의해 억제되는 것이 밝혀져 있다. 그러므로 이러한 apoptosis 관련 질환 치료를 위해 caspase 조절물질의 개발이 강력히 요구되고있다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 - 세포의 배양 및 Apotosis 의 유도: - Caspase 조절물질탐색을 위한 caspase활성의 측정: DEVD-dependent protease 활성 측정은 DEVD-AFC를 기질로서 사용하는 flouromeric 측정법이나 DEVD-pNA를 기질로 사용하는 colorimetric 측정법 을 사용하여 muti-well plate에서 측정한다. 또한 caspase를 사용한 활성 측정법을 병행한다. - Caspase활성조절물질의 분리정제 및 구조의 동정: Caspase활성을 조절하는 활성을 가지는 시료는 이를 대량확보하여 유기용 매분획, 각종 resin에 의한 분획 등에 의하여 물질을 순수하게 분리하여 NMR, MS등의 기기분석을 통하여 구조를 동정한다. Ⅳ. 사업수행(연구개발) 결과 Apoptosis signal cascade와 관련된 caspase의 조절물질 중에서 기대되는 분야가 항암제 개발 이외에 뇌허혈, 간 독성 등의 치료제 분야라 할 수 있다. 이에 따라 U937 세포를 이용하여 기존의 apoptosis 유도물질 탐색법을 보완한 caspase 유도 조절물질 탐색계를 확립하고자 하였으며, 이를 이용하여 천연물로부터 조절물질을 탐색하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Caspase 활성 조절물질 탐색계의 구축 Caspase활성 발현 조절물질의 탐색계 확립 U937 세포를 이용하여, 96well plate를 이용한 apoptosis 조절물질 탐색계를 확립하였다. 그 결과 10 uM의 etoposide 및 sample을 처리하여 apoptosis를 유도한 후 얻은 lysate를 이용하여 caspase 3의 활성을 Ac-DEVD-AFC를 기질로 측정하였다. Etoposide를 투여한 경우 유도된 caspase 활성과 비 투여시의 활성을 기준으로 각 시료의 저해 활성을 환산하였으며, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)를 표준 caspase 3 유도 저해제로 사용하였다. Caspase활성 저해물질 탐색계의 확립 Caspase3 활성 검색은 DEVD-AFC, -AMC, -pNA 기질 중 -AFC 기질이 가장 좋은 감도를 나타내었으며, 형광 기질을 사용한 1 차 탐색 후 이를 확인하기 위해 HPLC를 이용한 2 차 검색을 확립하였다. 또한 분리물질의 활성을 검정하기 위하여 DNA fragmentation, MTS assay, DPPH radical scavenging 등의 assay를 실시하였다. 2. Caspase 활성 조절물질의 탐색 세포주를 이용한 caspase 유도 조절 물질 탐색 및 caspase3 효소를 이용한 저해제 탐색을 병행하였다. 천연물 및 미생물 대사산물로부터의 탐색: 천연약제 500 여종, 방선균 1000여종, 곰팡이 1000여종을 대상으로 탐색하여 최종적으로 천연 약제 4종, 방선균 3종, 곰팡이 3종을 선발하였다. 2-1. Caspase 유도 조절물질 분리 머위로부터 caspase 유도를 저해하는 petasiphenol을 분리 동정하였다. Petasiphenol은 이 물질은 IC50 8 μg/㎖의 농도로 U937 세포주의 etoposide에 의한 caspase 3 유도를 저해하였으며, DNA fragmentation도 저해하였다. 또한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능을 나타내었다. 곰팡이 F80834 균주로부터 활성물질을 분리한 후 NMR, MS 등의 기기분석을 실시한 결과 terrein, butyrolactone I, II로 그 구조를 각각 결정하였다. Butyrolactone I은 25 μM, 6시간의 조건에서 apoptosis를 유도하였으나, butyrolactone II는 etoposide에 의해 유도된 apoptosis를 저해하였다. Butyrolactone I, II는 모두 DPPH radical 소거능을 나타내었으나, xanthine/xanthine oxidase에 대해서는 butyrolactone I만이 저해활성을 나타내었다. Terrein은 IC50 20μg/㎖의 농도로 U937 세포주의 etoposide에 의한 caspase 3 유도를 저해하였다. Etoposide에 의한 세포의 사멸도 IC50 10μg/㎖의 농도로 저해하였으며, 동일한 농도 조건에서 단독 처리시 세포 독성을 나타내지 않았다. 곰팡이 F90007의 균사체로부터 3개의 활성물질을 분리하였으며, NMR, EI-MS 등의 기기분석 결과 palmitic acid, stearic acid, linoleic acid로 그 구조를 각각 결정하였다. 각종 fatty acids의 apoptosis 조절활성을 비교한 결과 myristic acid (C14), palmitic acid (C16) 등의 saturated fatty acids가 농도 의존적으로 10 μM etoposide에 의해 유도된 caspase-3활성과 DNA fragmentation을 저해하였다. Palmitic acid는 60 μM농도에서 8시간만에 U937 cells의 caspase-3를 400% 유도하였다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 본 연구에 의해 caspase 유도 조절물질 탐색법이 확립되었으며 천연물 및 미생물 기원 시료에 대한 활성물질 탐색결과 여러 종의 물질이 개발되었다. Terrein은 Terrein은 낮은 세포 독성을 나타내는 화합물로, etoposide에 의해 유도된 세포사멸을 농도 의존적으로 저해하여 세포를 보호하는 활성을 나타내었다. 최근 신경세포나 간세포에 대한 보호물질의 개발이 절실히 요구되는 시점에서 본 연구에 의해 새롭게 밝혀진 terrein의 생물활성과 그 작용기작에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료되며, 그 결과 새로운 개념의 항암제, 뇌허혈성 질환 치료제 등이 개발되어질 것으로 기대된다. 또한 개발된 혹은 앞으로 개발된 caspase 유도 조절물질의 기작규명 작업을 통하여 세포사멸관련 signal이 규명되어질 것이다.
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