보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1999-10 |
주관부처 |
과학기술부 Ministry of Science and Technology |
연구관리전문기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
등록번호 |
TRKO200200051119 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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초록
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I. 제목 종양관련 유전자의 체계적 분석 II. 연구개발의 목적 및 필요성 본 과제는 유전정보가 담긴 게놈(genome) DNA의 구조분석으로 유용한 유전자를 발굴하는 과제의 일부로서 인체세포의 분화과정에 관여되는 아직 밝혀지지 않은 새로운 유전자들을 분리, 분석하여 그 기능을 조사함으로써 세포의 분화과정을 이해하여 세포분화의 이상에 기인하여 생기는 인체질병의 원인규명에 이용하고자 하는 연구이다. 인체 세포분화과정은 각 세포마다의 기능에 따라 여러 유전자들이 관여되어 분화되면서 고유의 세포내 기능을 담당한다.
I. 제목 종양관련 유전자의 체계적 분석 II. 연구개발의 목적 및 필요성 본 과제는 유전정보가 담긴 게놈(genome) DNA의 구조분석으로 유용한 유전자를 발굴하는 과제의 일부로서 인체세포의 분화과정에 관여되는 아직 밝혀지지 않은 새로운 유전자들을 분리, 분석하여 그 기능을 조사함으로써 세포의 분화과정을 이해하여 세포분화의 이상에 기인하여 생기는 인체질병의 원인규명에 이용하고자 하는 연구이다. 인체 세포분화과정은 각 세포마다의 기능에 따라 여러 유전자들이 관여되어 분화되면서 고유의 세포내 기능을 담당한다. 이 세포분화과정의 조절은 positive 또는 negative selection을 거치면서 정확한 프로그램에 의해 진행된다. 만약 이 과정에서 조절의 균형이 깨어져 비정상적인 세포로 발전하면 인체에서 질병의 원인이 된다. 특히 암세포로의 전환과정에는 정상세포의 성장 및 분화과정에서 조절의 불균형에 의해 야기된다고 볼 때 세포의 분화과정에 관여하는 인자들을 밝히는 일은 생명현상의 기본적인 이해와 인체질병의 원인규명에 절대적으로 필요한 과정이다. 암세포로의 분화되는 과정에는 여러인자들의 발현이 유도되며 특정 암세포에서는 특정한 유전자의 발현이 과다하게 일어나거나 유전자 자체의 구조변화에 의해 암세포로 분화된다. 현재까지 세포분화에 관련된 인자들의 존재는 예측되고 있으나 아직 체계적인 발굴은 되고 있지 않은 상황이므로 인체게놈에 존재하는 유전자들 중에 이러한 정상적인 세포분화에 관련된 유전자들을 체계적으로 발굴하여 그 구조를 분석하고 분화과정에서의 기능을 규명하는 일은 새로운 유용한 유전자를 분리할 수 있는 근본기술이 되며 암세포로 분화되는 과정에 관련되는 유전자를 발굴하여 비교분석함으로써 세포분화기능이 상실되거나 또는 과도하게 분화되어서 일어나는 질병에 대한 이해를 하는데 좋은 자료가 될 것이다. 또한 이를 효과적으로 이용하면 질병치료에 사용될 수 있으므로 인체의 정상적인 세포분화 및 암세포로의 분화과정에 관련된 아직 밝혀지지 않은 인체유전자의 체계적 발굴은 필수적이다. 본 과제의 최종목표는 인체 세포분화단계에 관여하는 유전자들을 체계적으로 발굴하여 그 구조를 분석하고 기능을 밝힘으로써 신규 유용한 유전자의 확보와 인체질병치료의 근본 자료로서 이용할 목적으로 각종 세포분화중에서 인체 암세포로 분화되는데 관련되는 새로운 유전자를 집중발굴하여 그 유전자의 게놈구조를 분석하고 기능을 밝혀 암발생 원인 규명에 이용하고자 하였다. 특히 인체 유발암중에서 한국인에 많은 위암 및 간암을 주 대상으로 하여 원인유전자를 체계적으로 발굴하고 분석하여 위암 및 간암 예방과 치료에 유용한 물질 개발에 사용하고자 하였다. 이중 1단계 최종목표는 위암 및 간암유발과 관련된 신규 유전자군의 대량분리를 목표로 하였다. III. 연구개발의 내용 및 범위 종양관련된 신규 유전자발굴을 위하여 연차별로 다음과 같은 연구내용을 중심으로 추진하고자 하였다. 1차년도(1996년) : 인체 세포분화 관련 신규 유전자 탐색 암세포를 대상으로 암세포에서 특이적으로 발현되거나 DNA상의 구조변화가 있는 유전자군의 발굴을 위한 시스템 구축과 이를 이용한 유전자 분리 2차년도(1997년) : 한국인 유래 암세포 조직(위암, 간암, 자궁암, 난소암, 면역종양)으로부터 암세포 분화에 관련된 유전자분리 및 분석 3차년도(1998년) : 분리된 암세포 분화 관련 유전자들의 게놈구조분석 및 기능분석 1, 2차년도 연구까지는 인체 각종암, 즉 위암, 간암, 자궁암, 난소암, 면역종양암을 대상으로 관련 신규 유전자 탐색을 주 연구내용으로 진행하였으며 3차년도에서는 좀더 효율적인 연구를 추진하기 위하여 한국인에 많은 위암, 간암을 집중대상으로 선정하여 분리된 신규 유전자들에 대한 구조분석과 초기단계 기능분석연구에 집중하였다. 그러므로 자궁암/난소암, 면역종양 관련된 신규 유전자들은 2차년도 연구후 연구를 종료하였다. 각 연도별 주 내용은 시스템”에 관한 연구과제가 3차년도에는 본 세부과제로 통합되어 본과제에서 발굴된 신규 유전자의 체계적 기능분석을 위한 시스템 구축이 촉진되었다. 1차년도 (1996년) 암세포분화 관련된 유전자의 체계적 발굴을 위하여 RNA의 발현차이가 있는 clone들과 DNA상의 구조변화가 있는 clone들을 발굴할 수 있도록 differential display방법 및 2차전기영동방법을 이용한 분석체계를 마련하여 위암, 간암, 난소암조직 및 관련 세포주로 부터 RNA 및 DNA분리 및 분석을 시도하였다. 1. RLGS 방법에 의한 위암 관련 유전자 동정 암세포 분화 관련 유전자의 체계적 발굴을 위하여 DNA상의 변화를 조사하는 RLGS 분석체제를 구축하였으며 이를 이용하여 한국인으로부터 유래한 위암조직의 DNA를 분리하여 Not1-EcoRV-Hinf 제한효소로 처리하여 2차 전기영동법으로 분석을 진행하였다. 충남대학교 의과대학교와 울산의대에서 내원한 138환자로부터 각각 위암조직 및 정상조직, 림프절, 혈액 등의 시료를 채취해 각각의 DNA를 정제 분리하였으며, 이중 23명 환자로부터의 위암 및 정상조직이 현재 분석 완료되었고, 2명의 환자의 경우에는 림프절을 동시에 분석하였다. 2. Differential display 및 subtraction hybridization 방법에 의한 간암, 난소암, 조직 및 세포주에서 발현이 변화하는 유전자 분리 간암, 특이적으로 발현되는 유전자분리를 위하여 정상조직과 간암조직, 태아간조직, 간세포주(HepG2, HepG3B, HBV의 X-gel이 integration된 간세포주)에서 RNA를 분리하였고 이들에서 발현의 차이를 보이는 클론들을 선정하기 위하여 3'-primer (T11G, T11A, T11C)와 5'-primer (Ap1-8)를 사용하여 RT-PCR을 실시하여 간암조직과 정상조직에서 발현의 차이를 보이는 클론을 선정하였다. 또한 대조군으로서 정상조직, 인체 태아 간조직 간암조직 및 간암 세포주에서 추출된 RNA들도 함께 실험에 사용하였다. PCR에 의하여 증폭된 cDNA중 발현의 차이를 나타내는 클론들의 선정을 위하여 6% acrylamide denaturating gel에서 전기영동을 실시하였다. 난소암 및 자궁암에 특이적으로 발현되는 유전자분리를 위하여 한국인으로 부터 유래한 난소암조직과 자궁암조직 및 정상조직으로 부터 RNA를 분리하였고 3' T11M primer 및 5' AP1-8 primer를 이용하여 RT-PCR 방법으로 cDNA를 제조하였고 정상조직과 난소암 및 자궁암조직에서 발현차이가 있는 band들을 분리하였다. 또한 자궁암의 경우 자궁암유발의 원인바이러스인 파필로마 바이러스의 E6 및 E7 유전자가 integration된 자궁암세포주를 제조하여 E6 및 E7 유전자가 없는 자궁세포주와의 DDPCR를 수행하여 암유전자 E6 및 E7에 의해 발현이 달라지는 clone들을 분리하였다. 3. 발현차이가 있는 clone들의 분석 DDPCR 방법에 의해 암조직에서 발현의 차이가 있는 clone들의 발현을 확인하기 위하여 선정된 클론들은 같은 primer를 사용하여 PCR을 하여 다시 한차례 증폭한 다음 32P-(d)ATP로 표지하여 probe로 사용하였으며 각각의 조직에서 추출한 후 nylon membrane에 blotting된 mRNA와 hybridization을 실시하였다. 이중에서 Northern blotting 기법으로 분석한 결과 유의성이 있는 클론들을 선정한 다음 TA cloning kits를 사용하여 cloning 하였으며 각각의 클론은 Sanger 등이 사용한 dideoxynucleotide를 이용한 termination 방법으로 부분 염기서열을 결정하였고 동시에 Northern blot 방법을 통하여 그 결과를 재확인하였다. 확정된 clone들을 Blast program을 통한 염기서열 분석과 PIR,SWISS-PROT 및 database를 이용하여 아미노산서열 분석도 병행하여 실시하였다. 4. Substration에 의한 발현차이 유전자 분리 및 분석 정상조직과 암조직간에 발현차이가 있는 clone을 확보하기 위하여 정상간 또는 난소mRNA로 부터 double strand cDNA를 제조하였고 tester로서 사용되는 암조직으로 부터 만든 cDNA와 driver로서 사용되는 정상조직으로 부터 만든 cDNA를 RsaI 제한효소로 처리한 후 절단된 cDNA 중 tester를 둘로 나누어 각각 다른 adapters를 붙인 후 driver와 hybridization을 시키고, 다시 PCR을 통하여 증폭하여 tester의 cDNA 염기서열만을 선택적으로 증폭시켜 subtraction을 실시하였다. 이렇게 증폭된 cDNA를 TA cloning kit을 사용하여 cloning 하였고 상기와 같은 방법으로 클론들의 부분 염기서열을 결정하였다. 5. 면역종양 관련 유전자 분리 면역종양을 유도하는 유전자 발굴을 위하여 국내에서 tonsil lymoma 환자로 부터 얻은 조직으로 부터 random cDNA library를 제조하기 위하여 mRNA를 분리하였고 이로부터 cDNA를 합성하여 0.5kb이상되는 cDNA를 size fraction을 통하여 분리하고 uni-ZAPXR 벡터에 cloning한 후 directional cDNA library를 제조하였다. 제조한 library로 부터 random하게 clone을 선택하여 partial DNA sequencing분석을 수행하였다. 6. 암조직 특이적으로 변화되는 clone의 염색체내 위치결정을 위한 cosmid library 제조 및 cos96 system 구축 각 종암에서 분리되는 새로운 clone들의 성질을 규명하기 위해서는 이들의 염색체내 위치결정이 우선 따라야 하므로 이들의 chromosome mapping에 필요한 시스템 구축을 진행하였다. 2차년도 (1997년) 1차년도 연구결과로서 얻어진 clone들중에서 위암 및 간암을 주 대상으로 특이적으로 변화되는 partial clone들을 중심으로 이 clone들의 성질규명 및 분석을 목표로 하였다. 1. 위암관련 유전자 발굴에서는 1차년도의 연구결과 2차 전기영동젤상에서 변화를 보인 spot들의 cloning과 이들의 genomic DNA를 얻고 이들의 염기서열결정 및 염색체상의 위치결정을 추진하고자 하였다. 가. 위암조직과 정상위조직에 대한 이차원전기영동 분석의 확대 위암-정상위조직에 대한 이차원 전기영동 분석대상을 확대하여 총 50명의 환자에 대한 RLGS profile을 작성하였다. 나. RLGS profile에서 spot DNA의 클로닝 및 염기서열 분석 일차년도를 통해 작성된 정상위조직 대비 위암조직에서 특이적으로 발생하는 변화DNA에 대한 RLGS profile로부터 유형별 DNA를 클로닝하고 이들의 염기서열을 분석하였다. 대상 DNA는 크게 위암조직에서 특이적으로 copy number가 증가하는 DNA와 위암조직에서 특이적으로 copy number가 감소하는 DNA로 대별할 수 있으며, 이중에서 전자의 경우에는 위암세포주 및 위암조직에서 동시에 발견되거나 copy number가 크게 증가한 DNA를 우선대상으로 하였다. 후자의 경우에는 23명의 환자 가운데에서 고빈도로 copy number가 감소한 DNA를 우선대상으로 하였다. 다. Southern blot 분석에 의한 spot DNA의 검증 확보된 DNA를 표지자로 이용하여 변화 DNA가 발견된 위암세포주 및 환자의 위암-정상위조직으로 부터의 genomic DNA를 NotI과 EcoRV의 제한효소로 각각 절단하고 이를 agarose gel 상에서 분리, NC membrane으로 이동시킨 후 각각의 표지자로 Southern blot 분석을 실시하여 copy number의 변화에 대한 검증하였다. 라. Northern blot 분석에 의한 기능성유전자에 대한 검증 위에서 검증된 표지자들에 대해 정상위조직으로부터 분리된 cellular RNA를 대상으로 Northern bot 분석을 실시하여 유전자발현 유무를 분석함으로써 기능성유전자를 포함하고 있는지를 검증하였다. 2. 간암, 난소암, 관련 유전자들 분석에서는 간암 및 난소암 특이 발현 clone들을 선별적으로 이들에 대한 full-length cDNA를 찾고 이들의 염기서열분석을 추진하고자 하였다. 또한 이 유전자들의 염색체상의 위치결정을 위하여 1차년도에서 체계가 구축된 cosmid library와 cos96 system을 이용하여 체계적인 chromosome mapping을 추진하고자 한다. 한편, 면역종양관련유전자탐색에서는 1차년도에 제조된 lymphoma cDNA library로 부터 random하게 cDNA를 선택하여 염기서열을 결정하고 이를 분석하여 lymphoma cDNA sequence들을 수집할 목표로 하였다. 3차년도 (1998년) 1, 2차년도연구에서 발굴된 위암, 간암, 난소암, 자궁암, 면역종양 관련된 유전자군들 중에서 3차년도에서는 위암과 간암 관련된 유전자의 분석과 기능 규명을 중점적으로 추진하고자 하였다. 1. 유전체분석 (RLGS)를 통한 위암발생 관련 유전자의 발굴 위암세포 특이적으로 변화를 보이는 spot DNA cloning 완결 및 염기서열 분석과 이들의 Genomic DNA분리 2. 위암 및 간암세포 특이적으로 발현하는 cDNA분리 위암, 간암세포에서 특이적으로 발현차이를 보이는 cDNA를 분리하고 이중 신규 유전자를 통정하여 full-length cDNA 분리 및 이들의 염기서열 분석 3. 신규 유전자의 염색체상 위치결정 및 구조분석 위암, 간암에서 특이적으로 변화된 clone들의 genomic mapping 및 근접 염색체 DNA분리 및 염색체상의 미세위치 결정 4. 위암 및 간암세포위 암발생 관련 신규 유전자의 기능분석 위암, 간암세포에서 특이적으로 발현 또는 미발현 유전자중 신규 후보 유전자에 대한 expression profiling의 작성 및 ES cell 수립 IV. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의 각 연차별 연구결과의 요약은 다음과 같으며, 3년동안 진행된 상세한 연구결과는 대상 암종별로 상세히 각 Chapter별로 서술하였다. 1차년도 (1996년) 1. RLGS방법에 의한 위암 조직 DNA 분석 가. 2D gel 상에서 위암조직 DNA의 intensified spot DNA의 검색과 염색체별 동정 2D gel 상에서의 intensified spot DNA (ISD)는 유전체내의 특정절편에서의 copy number의 증가를 의미한다. 일반적으로 유전체내 copy number의 증가는 아직 밝혀지지 않은 복제기작에 의해 발생하는 것으로 그 단위 (amplicon)는 수백kb에 이르는 것으로 알려져있다. 이때 cell cycle 및 signal transduction에 관여하는 유전자가 복제된 단위체내에 존재하고 있었다면 그 유전자의 발현이 상승할 수 있다. 따라서 ISD는 암유발유전자의 후보유전자를 탐색하는데 도움을 줄 수 있다. 본 연구에서 3개의 세포주로부터 8종의 ISD가 검출되었으며 이중 2개는 두 개의 세포주에서 동시에 검출되었다. 또한 23명 환자로부터의 위암조직에서 각각의 정상조직과 비교하여 21종의 ISD가 검출되었다. 이중 3종은 2명의 위암조직에서 공통적으로 검출되었으며 1종은 세포주의 것과 일치하였다. 따라서 총 28종의 ISD가 검출되었으며 이들의 각 염색체별 동정 및 분포를 살펴보면 8번 염색체로 부터 ISD가 3종, 9-12번 염색체로 부터의 ISD가 4종, 5 및 6, 13, 17, 19, 20, 22번 염색체로 부터의 ISD가 각각 1종으로 분석되었다. 나. 2D gel 상에서 위암조직 DNA의 decreased spot DNA의 검색과 염색체별 동정 2D gel 상에서의 decreased spot DNA (DSD)는 유전체내에서 NotI 제한효소 좌위의 소실 (loss)을 의미하며, 이는 LOH (loss of heterozygosity) 또는 CpG island 내에서의 methylation 변화에 의한 결과등, 두가지 원인의 하나로써 해석될 수 있으며, 그 결과 암억제유전자가 LOH에 의해 소실되거나, 혹은 암억제유전자의 promoter region이 methyl화 되어 transcriptional factor가 결합하지 못함으로써 loss of function이 유발된다. 따라서 DSD는 암억제유전자의 후보유전자를 탐색하는 지표가 될 수 있다. 본 연구에서 23 환자로부터의 위암조직을 각각의 정상조직과 비교한 결과, 2회 이상 반복적으로 검출된 총 DSD 수는 42개이었으며 이중 5회 이상 검출된 수는 2개, 4회 이상 검출된 수는 2개, 3회 이상 검출된 수는 14개, 나머지 24개는 2회에 걸쳐 검출되었다. 다. Intensified spot DNA의 cloning 2종의 위암세포주에서 동시에 발견된 2종의 DNA를 확보하고 염기서열분석 및 Southern blot 분석을 수행한 결과 이 두종의 DNA는 인체genome의 암발생유전자의 하나인 c-myc oncogene으로부터 유래되었음을 확인할 수 있었으며, 두종의 위암세포주의 genome내에 약 70배씩 공통적으로 증폭되어 있음이 확인되었다. 2. DDPCR 및 subtraction hybridization에 의한 간암, 난소암, 자궁암 특이 발현유전자분리 및 분석 가. 간암 특이 발현 유전자 분석 분리 (1) DDPCR에 의한 분석 DD RT-PCR을 통한 간암에서 발현이 증감되는 clone들을 분석한 결과 총 200여개 클론들이 일차 가능한 clone들로 분류되었으며 이 중 재증폭된 70개의 클론들을 탐색자로 사용하여 Northern 분석 결과 정상조직과 유전자 발현 상의 차이를 보이는 24개 클론들을 cloning하였고 그들의 부분 염기서열을 결정하였다. 클로닝한 후 부분 염기서열이 결정된 클론들의 유전자 발현형태 비교분석 결과 증폭된 PCR products를 이용하여 정상조직과 암조직 사이에 유전자 발현의 차이를 보이는 클론을 중심으로 TA cloning 벡터를 사용하여 유전자를 클로닝하고 클로닝된 유전자를 탐색자로하여 Northern blotting을 통해 발현의 차이가 재확인된 유전자는 발현의 차이별로 분류하였다. 자궁암의 경우 자궁암조직 cDNA의 DD-PCR결과 250개의 clone을 얻었으며 이중 일부 sequence 를 진행한결과 29개가 novel한 clone이었고 23개는 알려진 유전자이었다. 이들의 결과는 표 10-12에서 보는 바와 같다. 한편 자궁암의 원인 바이러스인 파필로마 바이러스에 의해 유도되는 유전자를 탐색하기 위하여 파필로마 바이러스의 암유전자인 E6 및 E7 유전자에 의해 조절되는 특정유전자를 분리하기 위하여 파필로마 E6 또는 E7 유전자가 integration된 세포주를 제조하기 위한 vector를 만들었으며 이를 자궁세포주에 통합시켜 E6가 integration된 자궁세포주를 만드는데 성공하였다. 3. 면역종양 유전자 분리 면역종양에 관련된 유전자분리를 위하여 한국인 tonsil lymphoma로 부터 분리한 RNA로 부터 cDNA library를 제조한 결과 primary library는 titer가 2.0 X 106 PFU/ml이었고 증폭된 library는 1.5 X 109 PFU/ml로서 98% 이상의 insert 율을 가지고 있어 좋은 library로 판정되었으며 이중 random하여 30여개의 clone을 분석하였다. 4. 종양 관련 유전자의 염색체상 위치결정 분석 각 종양세포에서 특이적으로 변화되는 clone들의 염색체상의 위치결정을 하기 위하여 이에 필요한 system 구축에서는 Insitu flouresence hybridization (FISH) 하기에 적절한 clone들을 찾기 위하여 위조직으로부터 genomic DNA를 추출하여 이를 pWE15 cosmid vector에 incorporation한 library를 제작하였다. Cosmid library의 colonies를 3차원으로 배열하여 screening의 정확도와 효율을 높인 Cos96 시스템을 구축하였으며 Cos96시스템의 검증을 위하여 위암조직의 RLGS에서 spot cloning된 genomic DNA으로부터 유래한 probe, cDNA로부터 유래한 probe (G4 spot), 그리고 기존에 밝혀진 Insulin유전자의 절편인 probe 세가지를 이용하여 PCR방법을 기반으로 screening을 수행하였으며, 최종적으로 선별한 colony에 대하여 Southern blotting을 수행한 결과 모두 정확하게 일치함을 관찰하였고 이 시스템은 전체 인간유전체의 최소 10배의 길이를 포함하고 있음을 증명하였다. 또한 Cytogenetic mapping을 위한 system의 확립을 확립하였다. 즉 Cytogenetic mapping을 수행하기 위하여 G-banding기술을 이용하여 종양환자로부터의 염색체표본에 대하여 핵형분석을 하고 염색체의 변이를 조사하므로써 banding기술을 확립하였다. 이과정에서 종양환자의 염색체형중 다수에서 polyploidy현상을 관찰하였다. 종양환자의 염색체 표본을 제작하고 이에대해 기존에 알려진 probe를 이용하여 FISH를 수행하여 FISH technique을 확립하였다. 종양조직을 계속적으로 수집하여 초저온으로 보관하는 동시에 차기연구개발단계에 필요한 표본을 제작하고 있다. 2차년도 (1997년) 1. 위암 및 간암 관련 신규 유전자 발굴 가. 위암에서 DNA 구조적 변화가 있는 clone 확보 RLGS방법으로 한국인 위암환자로부터 얻은 위암조직에서 분리한 genomic DNA를 분석하여 50명의 위암조직에 대한 분석이 완료되었으며, 이들 중 위암조직에서 DNA가 증폭된 것으로 나타난 spot DNA 34개와 DNA가 없어진 spot DNA 75개 및 위암조직에서 새로 나타난 spot DNA 21개들에 대한 clone을 확보하여 다음과 같이 분석하였다. (1) RLGS profile에서 spot DNA의 클로닝 및 염기서열 분석 지금까지 작성된 정상위조직 대비 위암조직에서 특이적으로 발생하는 변화DNA에 대해 유형별로 DNA를 확보하여 이들의 염기서열을 분석하였다. 대상 DNA는 위암조직에서 특이적으로 copy number가 증가하는 DNA와 위암조직에서 특이적으로 copy number가 감소하는 DNA로 하였으며, 이중 증가되는 spot DNA 9개와 (G1, G2, G3, G4, G5, G7, G8, G10, G26), 감소되는 spot DNA 27개가 클로닝에 의해 확보되었다. 이들 spot DNA 염기서열은 전자의 2개 spot (G1, G2)이 human c-myc protooncogene의 염기서열과 완전히 일치하는 것으로 나타났으며 G26은 human CDK6로 밝혀졌다. 다른 spot DNA 염기서열과 데이터베이스와의 유사성은 발견되지 않았다. 한편 후자의 clon# 43과 44, 그리고 45와 46은 각각 1D에서 NotI-NotI DNA 절편으로부터 유래된 것으로 분석되었으며, CA-RLGS에 의해 DP-43/44는 16번 염색체, DP-45/46은 3번 염색체로부터 유래되었음이 밝혀졌다. 그리고 H.sapiens CpG DNA clone#2a1 및 clone#9 (emb/X76667) 등을 포함하여 27개의 spot DNA가 확보되었으며 이중 일부는 mRNA로부터 유래된 것이 확인되었다. 따라서 2D gel상의 spot DNA의 약 20%는 유전자와 연관된 CpG island 또는 유전자자체로부터 유래되고 있음이 분석되었다. (2) Southern blot 분석에 의한 spot DNA의 검증 정상위조직 대비 위암특이적 spot DNA에 대해 Southern blot 분석를 진행하였으며 변화 확보된 spot DNA중 DP-43/44과 DP-45/46를 표지자로 이용한 Southern blot 분석을 수행하여 환자의 위암-정상위조직 사이의 genomic DNA변화가 분석되었다. 그 결과 NotI으로 절단한 위암조직의 DNA에서 정상대비 절반정도의 DNA band가 확인되었으나 methylation- insensitive 제한효소로 절단한 경우에는 두 DNA사이에 차이가 없었다. 이는 위암세포에서 해당영역의 CpG isalnd가 메칠화된 결과로 확인되었다. (3) 각 clone에 대한 염색체 위치확인을 위해 필요한 cosmid clone을 확보하였다. 나. 위암 및 간?보다 위암에서 발현이 현저히 증가되거나 감소되는 유전자군을 분리하기 위하여 정상조직 및 위암조직에서 분리한 RNA들을 대상으로 DD-PCR 방법을 적용하여 발현차이가 있는 clone들을 분석하여 현재 55개의 변화된 clone을 확인하였으며 이들의 sequence를 분석하고 있다. 또한 간암에서 발현이 증가하거나 감소되는 유전자 분리를 위하여 정상간조직과 간암조직으로부터 얻은 RNA를 재료로 cDNA library를 만들고 대량의 염기서열결정을 수행하였다. 그 결과 간암조직에서 발현이 크게 차이나는 24개를 확보하여 이들에 대한 상세한 발현증감정도를 Northern blot을 통하여 확인하였고 이들의 full-length cDNA확보를 위한 cDNA library screening을 하였다. (1) DDPCR에 의한 분석 DD RT-PCR을 통한 간암에서 발현이 증감되는 clone들을 분석한 결과 총 200여개 클론들이 일차 가능한 clone들로 분류되었으며 이 중 재증폭된 70개의 클론들을 탐색자로 사용하여 Northern 분석 결과 정상조직과 유전자 발현 상의 차이를 보이는 24개 클론들을 cloning하였고 그들의 부분 염기서열을 결정하였다. 클로닝한 후 부분 염기서열이 결정된 클론들의 유전자 발현형태 비교분석 결과 증폭된 PCR products를 이용하여 정상조직과 암조직 사이에 유전자 발현의 차이를 보이는 클론을 중심으로 TA cloning 벡터를 사용하여 유전자를 클로닝하고 클로닝된 유전자를 탐색자로하여 Northern blotting을 통해 발현의 차이가 재확인된 유전자는 발현의 차이별로 분류하였다. (2) subtraction hybridization에 의한 분석 정상조직과 간암조직으로부터 제조한 cDNA를 이용하여 두 library간의 subtraction hybridization을 통해 간암조직에서 발현차이를 보이는 clone 700개를 선택하였고 이들을 다시 간암 cDNA library probe와 정상조직 cDNA library probe으로 dot blot하여 간암조직에서 발현이 증가되는 clone들 16개를 분리하였다. 또한 태아 간조직 cDNA library로 부터 random 하게 염기서열 분석한 clone 4000개중에서 아직 그기능이 알려지지 않은 clone 730개와 현재 EST로 분류되어 있는 330개의 clone들을 정상 간조직 cDNA library probe와 간암 조직 cDNA library probe으로 dot blot hybridization 한 결과 60개의 clone들이 간암 조직에서 발현이 변화되는 것으로 나타났다. 다. 종양관련 유전자의 염색체상 위치결정 분석 위암 및 간암에서 변화가 있는 신규 유전자들의 염색체상의 위치를 결정하기 위하여 이에 필요 Insitu fluorescent hybridization (FISH) 체계를 확립하였으며, 위암 간암에서 발굴된 genomic DNA나 cDNA의 full length clone을 찾기 위하여 cosmid library를 한국인 정상위조직 DNA로부터 제조하여 스크리닝을 신속하고 다량으로 수행할 수 있는 COS96 시스템을 개발하였다. 2. 난소암 특이 유전자 분리 한국인 여성에 다발하는 암인 난소암 유발원인유전자들을 분리하기 위하여 한국인 난소암조직으로부터 분리한 RNA를 대상으로 DD-PCR방법을 적용하여 분석한 결과 232개의 clone을 일차 얻은 후 이들에 대한 상세한 분석을 통하여 118개의 clone이 유의성있는 clone으로 얻어져 이들의 염기분석을 한 결과 26개가 새로운 유전자인 것으로 분류되었고 31개는 이미 알려진 유전자이었다. 이 중 2차년도 연구에서는 난소암과 관련이 깊은 것으로 예상되는 steroid hormone receptor (N33) 및 Ner1과 새로운 유전자 두 개에 대한 full-length cDNA를 분리하여 있으며 이들에 대한 성질규명을 위하여 이들을 난소암 세포주에 도입하는 plasmid를 제조하였다. 또한 자궁암 관련에서 발현차이가 있는 clone을 확보하여 분석한 결과 표에서 보는 바와 같이 99개의 clone들에 대한 동정을 마쳤다. 3차년도 (1998년) 1, 2차년도 연구에서 확립된 정상세포 및 암세포에서의 발현차이를 구별할 수 있는 시스템(Differential Display Polymerase Chain Reaction)과 DNA구조변화를 탐색할 수 있는 RLGS (Restriction Landmark Genome Scanning)시스템을 이용하여 실제로 각 암에서 발현차이 및 DNA구조변화가 있는 유전자들의 분리를 하였으며 이들 중 위암 및 간암발생과 관련성이 있는 유전자들을 중심으로 이들의 clone 염기서열분석을 완료하였고 이 clone들을 포함하는 주변 염색체상 DNA분석 (cosmid, Bac clone 분리)하여 염색체내 위암 및 간암 관련된 유전자들의 위치 분석과 이들의 염기서열분석을 진행하였다. 또한 위암 및 간암발생 관련이 있는 유전자 clone들을 중심으로 그 기능 규명을 진행하였다. 특히 3차년도 연구에서는 1, 2차년도에서 발굴된 위암, 간암, 난소암, 면역종양 암과 관련유전자들 중에서 위암 및 간암에 관련된 유전자들을 집중적으로 분석하는 전략으로 연구를 진행하였으며 이들의 기능 분석도 제4세부과제의 기능분석과제와 공동연구과제로 구성하여 진행하였다. 1. 위암 관련 신규 유전자 발굴 가. RLGS profile에서 spot DNA 클로닝 및 염기서열 분석 정상위조직 대비 위암조직에서 특이적으로 발생한 유전체변화에 대해 완성된 RLGS profile로부터 유형별 DNA 클로닝을 수행하고 이들의 염기서열을 분석하였다. spot DNA는 크게 위암조직에서 특이적으로 copy number가 증가하는 DNA와 위암조직에서 특이적으로 copy number가 감소하는 DNA로 대별할 수 있으며, 이중에서 전자의 경우에는 위암세포주 및 위암조직에서 동시에 발견되거나 copy number가 크게 증가한 34종의 spot DNA를 우선대상으로 하였으며, 후자의 경우는 57명의 위암환자에서 고빈도로 copy number가 감소한 81개의 DNA를 대상으로 하였다. 현재 전자의 경우 12개 및 후자의 경우, 38개의 spot DNA의 클로닝이 완료되어 염기서열이 결정되었다. 나. Spot DNA 염기서열의 특성별 분류 및 검증 클로닝 및 염기서열이 완료된 spot DNA들은 database와의 상동성 검색을 통해 1) 이미 알려진 인체유전자 혹은 유전체 DNA와 동일한 부류, 2) 인체에서는 동일성이 검색되지는 않았으나 모델생물에서 유사유전자로서 추정되는 부류, 3) 인체 및 모델생물과 전혀 유사성이 검색되지 않는 부류로 분류되었다. 한편 위암 특이적으로 copy number가 감소된 spot DNA의 경우에는 위암조직과 위암세포주에서 연속성을 갖는 경우와 단지 위암조직에 국한하여 감소된 경우로 대별하여 연속연구를 수행 중이다. 다. Significant spot DNA의 유전체 분석 및 cDNA의 분리 (1) Southern blot hybridization 분석 위암 환자군에서 고빈도로 copy number가 감소된 spot DNA (#003)을 대상으로 이 유전체변화가 염색체 일부의 결실 (LOH, loss of heterozygosity)에 의한 결과인지, 아니면 CpG isalnds에서의 methylation change에 의한 결과인지를 판정하기 위해 Southern blot hybridization 분석을 수행하였다. 그 결과, 인간 3번 염색체로부터 유래한 DNA단편에 존재하는 CpG islands에서의 methylation에 의한 결과임이 판정되었다. (2) Northern blot 분석에 의한 기능성유전자에 대한 검증 #003의 DNA단편 부근에서 기능성유전자의 존재 및 정상위조직과 위암세포사이에서의 발현차이를 검증하기 위하여 각각의 RNA를 대상으로 Northern blot hybridization을 수행하였다. 그 결과 정상조직에서 유의한 signal이 확인된 반면 위암세포의 경우 매우 미약한 signal이 검출되었다. 따라서 정상조직에서는 발현되나 위암??음이 확인되었다. (3) Cosmid 및 BAC clones의 분리 및 유전체 분e Library 중 3번 염색체 library로부터 2개의 cosmid clones을 확보하였으며, 그리고 CalTech 및 RPCI로부터의 Human BAC Library로부터 BAC clone이 확보되었다. 이들 clone들은 #003 DNA의 존재가 검증되었으며 현재 위암세포 특이적으로 발현이 저하되는 신기능 유전자의 발굴을 목표로 cDNA screening, short-gun sequencing등을 통한 유전체의 구조분석이 진행중이다. (4) FISH에 의한 염색체상 미세위치 결정 위암세포 특이적으로 발현이 저하되는 신기능 유전자의 염색체성 미세위치를 결정하기 위하여 cosmid 및 BAC 클론을 재료로 FISH (fluorescent in situ hybridization)기법을 사용하여 3번 염색체상의 미세위치가 결정되었다. 라. 위암조직에서 발현이 특이적으로 변화하는 cDNA 분리 정상조직보다 위암에서 발현이 현저히 증가되거나 감소되는 유전자군을 분리하기 위하여 정상조직 및 위암조직에서 분리한 RNA들을 대상으로 DD-PCR 방법을 적용하여 발현차이가 있는 clone들을 분석한 결과 200여개에 대한분석을 완료하였으며 이중 기능이 알려지지 않은 신규한 clone 은 40개인 것으로 보이며 이 중 7종의 clone은 상세한 기능연구가 필요한 유의성있는 clone이다. 2. 간암관련 신규 유전자 탐색 간암에서 발현이 증가하거나 감소되는 유전자 분리를 위하여 정상간조직과 간암조직으로부터 얻은 RNA 대한 DD-PCR 분석, PCR-based substraction, Dot hybridization 을 통하여 얻어진 clone들에 대한 염기서열분석 및 기능분석을 진행하였다. 간암조직에서 발현이 크게 차이나는 24개들에 대한 상세한 발현증감정도를 Northern blot을 통하여 확인하였고 이들의 full-length cDNA확보를 위한 cDNA library 구축을하였으며 이들 clone중 14개에 대한 상세한 기능분석을 진행하였다 가. 다양한 간암조직의 확보 선정된clone 들에대한 상세한 발현분석을 위하여 현재 50여 개의 간암 조직을 대학병원과 협조하여 간암 또는 다른 질병으로 수술을 받은 환자들로부터 수집하여 액체질소 내에서 보관 중 임 나. 간암 환자의 간조직에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현분석 DD RT-PCR, PCR-based subtraction, dot hybridization 등의 방법을 사용해 간암 조직, 정상 성인의 간조직, 태아 간조직 등을 대상으로 하여 각각의 유전자들이 여러 조직에서 발현돠는 양상을 비교/분석하였으며 이들 유전자 중에서 간암 환자의 간조직에서 특이적으로 발현되는 cDNA 클론들을 선정하고 이들의 발현특성을 Northern blot hybridization 방법으로 확인하는 실험을하였다. 다. 기능분석을 위해 1차적으로 선정된 유전자들의 발현특성 및 염기서열 분석 6개 유전자를 1차적으로 선정하여 특성연구를 위한 실험을 진행하고 있다. 선정된 유전자들은 전체 혹은 부분적인 cDNA 염기서열을 클로닝하였고 클로닝된 전체 혹은 부분 cDNA 클론의 핵산 염기서열을 결정하였으며 간암 환자의 간조직에서의 발현특성을 Northern hybridization 방법으로 분석 완료 (1) URE-B1 homolog - UreBP의 조직내 발현특성과 간암과의 관련성을 조사하기 위해 선정된 새로운 유전자 - 지금까지 분석된 모든 간암 환자의 간조직에서 그 전사체(mRNA)가 더 높은 수준으로 발현되었다. - 간암 환자의 간조직에서만 UreBP의 PCR 산물이 점차적인 증가를 보임을 확인 - 상기 신규유전자의 full length DNA 클로닝 및 염기서열 결정 (2) PTTG gene - 쥐에서 발견된 rat pituitary tumor transforming gene(PTTG)의 상동 유전자 - full length cDNA 클로닝 및 염기서열 결정 완료 - 간암 환자의 간조직에서 발현이 증가함을 Northern blot hybridization 방법으로 확인 -기능연구를 위해 재조합 단백질로 발현시키기 위한 발현벡타 제작을 완료 및 E. coli 균체내에서 재조합 단백질 발현 (3) EST clone, E2E08 - Dot hybridization 방법으로 분리된 새로운 유전자 - 부분 염기서열의 크기(insert size) : 0.8kb (4) EST clone, E2F09 - Dot hybridization 방법으로 분리된 새로운 유전자 - 부분 염기서열의 크기(insert size) : 0.4kb (5) EST clone, E4C09 - Dot hybridization 방법으로 분리된 새로운 유전자 - 부분 염기서열의 크기(insert size) : 0.5kb (6) EST clone, S28E09 - Dot hybridization 방법으로 분리된 새로운 유전자 - 부분 염기서열의 크기(insert size) : 0.4kb 3. 위암, 간암 관련 신규유전자에 대한 기능 분석 가. 발굴된 종양관련 후보유전자에 대한 expression profiling 및 기능적 분류 정상간세포와 간암세포간의 발현양상의 현저한 차이를 보이는 clone 400여개를 제 1 세부과제로부터 넘겨받아서 이들을 세포성장, 분화, 사멸 등을 대변할 수 있는 RNA source로부터 만든 cDNA probe를 이용하여 reverse Northern방법으로 그 기능을 심화분석하고 있다. Reverse Northern에 사용할 probe를 제조하기 위하여 정상간 또는 간암세포주를 간암의 발병/진행과 연관된 요인으로서 growth factor (TGF-β, EGF, HGF, IGF-II 등), cytokine (IL-6), oxidative stress(H2O2), HBx 등으로 처리한 다음 cDNA probe source로 이용하기 위해 여러 시간대별로 RNA를 제작했다. 현재 이 cDNA probe를 이용한 기능분석 작업이 진행중이다. 또한 이 유전자들이 간암의 진행과정중 어느 단계에서 작용하는지를 확인하기 위해 형질전환 간암모델동물에서 tumor nodule을 시간대별로 분리하고 각각으로부터 RNA를 뽑아 이를 cDNA probe로 사용중이다. 그리고 해당 clone들의 이종개체간 유전적인 conservation여부를 expression zoo blot을 통해 분석중이다. 또한 해당 clone들의 발현양상을 여러 시간대별로 회수한 regenerating rat liver RNA를 probe로 사용해서 초기, 중기, 말기로 개괄적인 분류를 하고 있다. 나. 종양관련 후보유전자에 대한 genomic DNA 재배열 여부조사 종양관련 후보유전자들의 genomic DNA 재배열 여부를 조사하기 위하여 형질전환 간암모델동물에서 50개 이상의 tumor nodule을 분리하여 genomic DNA를 추출하였다. 일부 선별된 후보유전자들에 대하여 정상 간조직과 종양조직의 genomic DNA blot을 이용하여 이들의 재배열과 deletion 여부를 확인중이다. 다. Expression profiling과 genomic DNA 상태조사에서 발굴된 3-5종의 주요 후보유전자에 대한 형질전환동물모델의 수립 제 1 세부과제에서 선별한 주요 간암후보유전자의 in vivo 기능을 연구하기 위하여 형질전환 동물모델을 제작하고자 하였다. 현재 선정된 6종의 간암 후보유전자를 더욱 선별하기 위하여 상기 1)과 2)에서 언급된 시스템을 적용하여 Northern분석 및 Southern 분석을 시행하고 있으며, 이중 1종에 대해서는 albumin gene expression system을 이용하여 동물형질전환용 expression vector를 제작중에 있다. Ⅴ. 연구개발의 활용계획 한국인 유래하는 위암, 간암에서 이와 관련되는 신규 유전자를 발굴하고 이들의 유전자 성질을 규명함으로써 한국인의 위암 및 간암 발생 원인 유전자를 찾을 수 있고 이를 이용하여 한국인에게 많이 발생되는 위암과 간암??른 나라에서는 빈번하지 않아 연구의 대상으로서 활발하지 않은 위암 및 간암이지만 한국인에게 있는 암중에서 가장 많은 위암 및 간암을 대상으로 이와 관련되는 유전자를 발굴한 본 연구?는 marker로써 사용할 수 있을 것이며 위암 및 간암 관련한 신규 유전자들은 위암 및 간암 발생기전 규명에 이용될 수 있을 것이다. Ⅵ. 연구개발목표의 달성도 ① 위암관련 유전자 발굴 ② 간암관련 유전자 발굴 ③ 종양관련 유전자 기능분석 시스템 확립
목차 Contents
- 제1공동연구과제: 위암발생관련 유전자의 분리 및 기능분석에 관한연구...25
- 제2공동연구과제: 간암관련 유전자군의 체계적 분석에 관한 연구...78
- 제3공동연구과제: 자궁암/난소암 관련 유전자 탐색 및 특성 분석...121
- 제4공동연구과제: 면역종양세포로부터 질병관련 유전자 분리 및 동정...156
- 제5공동연구과제: 종양관련 유전자의 체계적 기능분석...185
- 위탁과제 : 종양관련유전자의 염색체상의 위치결정...208
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