초록 ▼

I. 제 목 바이오의약품 원료물질의 생산들 위한 복합 생물전환기술 개발 (Developement of multi-enzyme system for the synthesis and production of Biopharmaceutical intermediates) II. 연구개발의 목적 및 필요성 고부가가치 의약품 및 의약품합성 중간물질로 사용되는 방향족 D-amino acid 관련 생물전환생산기술로는 D-hydantoinase를 이용한 항생제 ampiciline의 합성중간물질인 D-phenylglycine (D-PG) 과 항생제

I. 제 목 바이오의약품 원료물질의 생산들 위한 복합 생물전환기술 개발 (Developement of multi-enzyme system for the synthesis and production of Biopharmaceutical intermediates) II. 연구개발의 목적 및 필요성 고부가가치 의약품 및 의약품합성 중간물질로 사용되는 방향족 D-amino acid 관련 생물전환생산기술로는 D-hydantoinase를 이용한 항생제 ampiciline의 합성중간물질인 D-phenylglycine (D-PG) 과 항생제 amoxicilline의 합성중간물질인 D-hydroxyphenylglycine (D-HPG)의 생산기술 개발연구(1-4)가 일본 ․유럽 및 국내에서도 활발하게 수행되고 있다. 그러나 최근 D-PG 및 D-HPG 이외의 다른 방향족 D-아미노산을 사용하여 고부가가치 의약품 및 의약품원료물질과 합성중간물질로의 개발연구(5-10)가 진행되고 있다. 이러한 기술개발의 추세에 있어 보다 더 다양한 방향족 D-아미노산을 고효율 ․낮은 원가로 생산할 수 있는 효율적이며 경제적인 생산공정기술의 개발필요성이 적극 대두되고 있다. 따라서 본 기술개발연구에서는 D-phenylalanine, D-tyrosine 및 D-tryptophan 등의 방향족 D-아미노산을 대량생산하기 위한 신생물전환공정의 개발을 목표로하여 복합생물전환기술연구를 수행하였다. 복합 생물전환공정계의 핵심이 되는 신규 생물촉매로써는 토양에서 분리된 신규 고온성 Bacillus 균주로부터 생산되는 내열성 D-amino acid aminotransferase(D-AAT)를 유전자조작을 통하여 재조합 대장균에서 대량생산된 D-AAT를 사용하였으며, 본 연구에 사용된 내열성 DAAT는 광범위한 기질특이성을 보유하고 있으며 열안정성에 따른 효소안정성과 유기용매에 대한 안정도도 보유하고 있어 (11-12) 각종 방향족 D-아미노산을 대량생산 하기 위한 신생생물전환공정의 개발에 최적으로 판단되고있다(13). 이러한 내열성 D-AAT를 기본생물촉매로 사용하여 원료 즉 기질의 효율적 이용을 위한 regeneration system을 도입하여 그림 1 과 같은 복합 생물전환공정계를 design 하였다. 이러한 복합 생물계를 이용하여 방향족 D-아미노산인 D-phenylalanine, D-tyrosine 및 D-tryptophan을 높은 수율로 생산하기위하여 복합 생물반응계의 검토와 생물전환반응의 최적화 연구를 수행하였다. III. 연구개발의 내용 및 범위 고부가가치 의약품 및 의약품합성 중간원료물질로 사용되는 방향족 D-아미노산 (D-Phenylalanine, D-tyrosine, D-tryptophan)의의 생산을 위하여 생물촉매를 복합적으로 사용한 복합 생물전환기술 개발을 목표로 다음과 같이 연구를 수행하였다. 1. 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환계의 Design 고효율 및 고생산성 방향족 D-아미노산의 생산기술을 확립하기 위하여 원료 기질의 효율적 이용을 목표로 regeneration system을 도입한 복합 생물전환계를 design 하였다. 2. 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 생물전환 반응계의 검토 (i) 저가의 기질인 L-glutamate로부터 D-glutamate의 glutamate racemase 를 이용한 생물전환반응계의 검토 (ii) D-glutamic acid로부터 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 D-amino acid amino-transferase 이용 생물전환 반응계의 검토 (iii) 고효율 및 고생산성 방향족 D-아미노산 생산기술을 확립하기위하여 regeneration system을 도입한 방향족 D-아미노산 생산 생물전환반응계의 검토 3. 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환반응계의 최적화 (i) 복합 생물전환반응계에의한 D-phenylalanine의 생산 (ii) 복합 생물전환반응계에의한 D-tyrosine의 생산 (iii) 복합 생물전환반응계에의한 D-tryptophan의 생산 IV. 연구개발 결과 1. 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환계의 Design 고효율 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환계를 확립하기 위하여 다음과 같은 생물촉매를 선정하여 복합 생물전환계를 design 하였다. 우선 국내에서 생산되는 저가의 기질(L-glutamate)로부터 고부가가치 방향족 D-아미노산을 생산하기 위하여 glutamate racemase(GluRA)의 유전자가 coding되어있는 Plasmid pGR3가 포함되있는 재조합균주 E. Coli/pGR3로부터 GluRA를 대량생산하여 L-glutamate로부터 방향족 D-아미노산의 기질로 사용되는 D-glutamate 생산 생물전환반응계를 도입하였다. 그리고 glutamate racemase에의해 생산된 D-glutamic acid와 방향족 D-아미노산 생산을 위하여 기질인 각종의 방향족 keto acid (D-phenylalanine생산시 사용되는 keto산; phenylpyruvate, D-tyrosine생산시 사용되는 keto 산; hydroxyphenylpyruvate, D-tryptophan 생산시 사용되는 keto산; indolpyruvate)를 사용하여 방향족 D-아미노산(D-phenylalnine, D-tyrosine, D-tryptophan)을 생산하는 D-amino acid aminotransferase(D-AAT) 이용 생물전환계를 도입하였다. 그리고 다시 D-AAT 생물전환반응후 생성되는 반응산물인 α-ketoglutaric acid를 glutamate dehydrogenase(GluDH)를 이용하여 다시 L-glutamate로 전환시키는 고효율의 생물전환반응계를 도입하였다. 이러한 각종 생물촉매의 생물전환 반응에 의해 소량의 L-glutamate와 keto acid만을 기질로하여 연속적으로 방향족 D-아미노산을 생산하는 고효율 ․고생산성 복합 생물전환반응계를 design 할 수 있었다. 그러나 GluDH는 NADH를 보효소로 하는 생물촉매이므로 생물전환반응후 생성되는 NAD+를 NADH로 전환시키기 위한 formate dehydrogenase(FDH, Boehringer Mannhem) 이용 regeneration system을 도입한 생물전환반응계를 구축하였다. 2. 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 생물전환 반응계의 검토 (i) Glutamate racemase(GluRA)를 이용한 생물전환반응계의 검토 D-glutamate는 D-AAT의 매우 좋은 아미노기의 공여물질이다. 저가의 L-glutamate 로부터 D-glutamate를 연속적으로 전환하여 공급한다면 복합 생물반응계에서 DAAT는 고효율로 α-keto acid를 D-아미노산을 할성할 것이다. GluRA는 L-glutamate로부터 D-glutamate의 전환반응을 촉매하는 생물촉매이다. 본 연구팀에서는 일본 Soda 교수 연구팀으로부터 GluRA의 유전자가 code되어있는 DNA단편을 포함하고 있는 plasmid pGR3가 들어있는 재조합균주 E Coli JM109/pGR3를 분양받아 본 연구실에서 재조합균주를 배양하여 GluRA의 조효소액을 제조하여 그 생물전환활성을 조사한 결과 GluRA는 높은 기질의 특이성을 가지고 있었으며, L-glutamate를 D-glutamate로 높은 수율로 전환함을 확인하였다. (ii) D-Amino acid aminotransferase(D-AAT) 이용 생물전환반응계의 검토 고온성 Bacillus 유래의 D--AAT의 유전자를 gene cloning하여 형질전환된 재조합 E. Coli HB101/pDA100로부터 대량생산된 D-AAT는 광범위한 기질의 특이성을 가지고 있어 생물전환반응 기질인 다양한 α-keto acid로부터 다양한 종류의 방향족 D-아미노산을 합성하였다. 또한 본연구 과제에서 사용된 D-AAT는 내열성 생물촉매로서 열안 정성을 보유함은 물론 유기용매 및 pH 등에 대해서 높은 안정성을 나타내었다. 내열성 D-AAT가 가지고 있는 다양한 기질에 대한 생물전환 특이성과 안정성을 고려할 때 D-AAT는 방향족 D-아미노산의 합성 및??산 생물전환반응계의 검토 기질의 효율적 이용기술을 확립하기 위하여 도입된 regeneration system을 구축하기 위해서 2종류의 생물촉매 GluDH 및 FDH가 사용하였으며, 저가의 기질로부터 고부가가치 방향족 D-아미노산을 생산하기 위해서 GluRA와 D-AAT가 사용되었다. 이와 같이 4종류의 생물촉매가 복합 사용되는 복합생물전환계를 이용하여 방향족 D-아미노산, D-tryrosine과 D-phenylalanine의 생산에 적용하였다. 사용된 생물촉매들은 조효소액 상태로 제조하여 생물전환반응에 사용하였다. 이 복합 생물반응계를 사용하여 높은 수유의 생산성과 고효율로 D-tyrosine과 D-phenylalanine이 성공적으로 생산됨을 확인하였다. 또한 방향족 D-아미노산합성 생물전환반응이 진행되는 동안 D, L-glutamate의 농도가 일정한 농도를 유지되므로 GDH와 FDH에 의해 L-glutamate와 NADH가 연속적으로 재생되는 것도 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 본 연구과제에서 개발된 복합효소 사용 생물전환 반응계는 효율적인 측면 뿐만 아니라 경제적인 면에서도 지금까지 개발된 방향족 D-아미노산 합성 및 생산기술보다 우수한 생물전환반응임을 확인하였다. 3. 방향족 D-아마노산의 생산을 위한 복합 생물전환반응계의 최적화 본 연구과제에서 개발한 복합 생물전환계의 최적화를 위한 방안으로 각 생물촉매들의 최적 반응조건들 조사한 결과, 반응 pH 8.5, 반응온도 37 ℃가 복합생물전환반응계에 최적임을 확인하였으며, ammonium-formate의 농도는 0.2M에서 1 M까지 생물전환반응에 안정성을 확인하였다. 이러한 방향족 D-아미노산의 생산을 위한 최적반응조건에서 원료 기질로 사용되는 α -keto acids의 최적농도를 구하고 최적농도에서 생산되는 방향족 D-아미노산의 합성 및 생산성을 조사하였다. (i) 복합 생물전환반응계에 의한 D-phenylalanine의 생산 복합 생물반응계에서 D-phenylalanine의 생산은 D-phenylalanine의 일차기질인 D-phenylalanine의 농도가 50-70 mM 에서 최고수준의 생물전환 합성속도를 나타내었으며, 기질의 농도가 100 mM 이상으로 증가하면 높은 기질억제가 나타났다. ammonium--formate의 농도를 500 mM로 고정하고 phenylpyruvate의 농도를 70 mM 이하로하여 연속적으로 공급한 결과, 복합 생물전환반응계는 시간당 약 8 mM의 phenylalanine을 생산하였다. 최종적으로 약 150 mM의 D-phenylalanine이 생산됨을 확인하였다. (ii) 복합 생물전환반응계에 의한 D-tyrosine의 생산 D-phenylalanine의 복합 생물전환반응계와 유사한 수준으로 D-tyrosine의 합성 및 생산기질인 hydroxyphenylalanine의 농도가 50-70 mM에서 최고의 합성속도를 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 기질억제현상이 나타났다. Hydroxyphenylalanine의 농도를 50-70 mM 이하로 유지되도록 생물전환반응을 수행하였을 때, 시간당 약 4-5 mM의 D-tyrosine이 합성을 확인하였으며 최종적으로 약 150 mM의 D-tyrosine 이 합성됨을 확인하였다. (iii) 복합 생물전환반응계에 의한 D-tryptophan의 생산 D-phenylalanine 및 D-tyrosine와 동일한 합성조건에서 복합 생물반응계를 이용하여 D-tryptophan의 합성을 수행하였다. D-phenylalanine 및 D-tyrosine의 합성 생물전환 반응과정에서와 마찬가지로 D-tryptophan의 합성기질인 indolpyruvate가 시간당 약 4-5 mM수준으로 전환됨을 확인하였다. 그러나 생성되는 D-tryptophan의 량은 시간당 약 2 mM에 머물렀다. 이러한 현상은 D-tryptophan 합성 생물전환반응계내에서 사용된 기질인 indolpyruvate가 쉽게 산화되어 나타나는 것으로 판단된다. 따라서 D-tryptophan의 경우에는 복합생물전환반응계에 환원제가 부가적으로 첨가되어져야 할 것으로 판단된다. IV. 연구개발 결과의 활용계획 고부가가치 의약품 및 의약품합성 중간물질로 사용되는 고부가가치 방향족 D-아미노산(D-phenylalanine, D-tyrosine 및 D-tryptophan)의 생산을 위한 복합 생물전환기술을 개발하여 다음과 같이 연구결과를 활용하고자 한다. (i) Regeneration system을 도입한 고효율 ,고생산성 생물소재의 생산기술 확립 (ii) 고부가가치 유용 ․의약용 방향족 D-아미노산의 생산기술의 기업화 및 상업적 생산을 추진하여 고부가가치 생물소재의 수입대체와 수출증진에 기여 (iii) 의약품 및 의약품합성 중간물질로 사용되는 D-아미노산을 개발하여 국민복지 및 건강증진에 기여

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...11
• 제 2 장 국내 ,외 기술개발현황...12
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과...14
• 제 1 절 실험재료 및 방법...14
• 1.사용균주와 plasmid...14
• 2.세포의 배양과 활성효소의 유도...14
• 3.효소의 분리...14
• 4.ChernicalS...14
• 5.분석방법...15
• 6.효소활성 측정...15
• 제 2 절 결과 및 고찰...16
• 1.방향족 D- 아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환계의 Design...16
• 2. 방향족 D- 아미노산의 생산을 위한 생물전환 반응계의 검토...17
• (i) L- Glutam ate로부터 D- - glutam ate의 glutam ate racernase를 이용한 생물 전환반응계...17
• (ii) D- Glutam ic acid로부터 D- 아미노산 생산을 위한 D- AAT 이용 생물전환 반응계...18
• (iii) Regeneration system 을 도입한 D- 아미노산생산 생물전환반응계...21
• 3. 방향족 D- 아미노산의 생산을 위한 복합 생물전환반응계의 최적화...23
• (i) 복합 생물전환반응계에의한 D- phenylalanine의 생산...23
• (ii) 복합 생물전환반응계에의한 D- tyrosine의 생산...25
• (iii) 복합 생물전환반응계에의한 D- tryptophan의 생산...25
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...28
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...29
• 제 6 장 참고문헌...30