초록 ▼

1) 혈소판 응집 단백질의 분리 정제 국내에서 발견된 TTP 환자의 혈청으로 부터 혈소판 응집에 관여하는 단백질, PAP(P37)를 순수 분리 정제한다.2) 혈소판 응집단백질의 생화학적 특성연구 혈소판 응집 단백질의 아미노 혹은 카르복시 말단부위의 아미노산 배열을 PTH-아미노산 유도체를 제조하여 peptide mapping 방법으로 결정하고, 단백질에 결합되어 있는 당쇄 부분의 조성등 구조적 생화학적 특성을 알아본다.3) TTP환자 혈장의 수집 혈장의 수집은 맨처음 혈장교환술(plasmapheresis) 당시에 얻은 혈장 2ℓ를

1) 혈소판 응집 단백질의 분리 정제 국내에서 발견된 TTP 환자의 혈청으로 부터 혈소판 응집에 관여하는 단백질, PAP(P37)를 순수 분리 정제한다.2) 혈소판 응집단백질의 생화학적 특성연구 혈소판 응집 단백질의 아미노 혹은 카르복시 말단부위의 아미노산 배열을 PTH-아미노산 유도체를 제조하여 peptide mapping 방법으로 결정하고, 단백질에 결합되어 있는 당쇄 부분의 조성등 구조적 생화학적 특성을 알아본다.3) TTP환자 혈장의 수집 혈장의 수집은 맨처음 혈장교환술(plasmapheresis) 당시에 얻은 혈장 2ℓ를 동결건조기(Labconco cascade freeze dryer 18, USA)로 즉시 동결건조 하였다. 동결건조된 혈장의 무게는 340g 이었고, 이것을 -70℃에서 보관하였으며 필요시 사용하였다.4) 세척 혈소판 수용액의 준비 혈소판은 O형 혈액형을 가진 정상 성인의 전완 정맥에서 혈액을 채취하여 3.8%의 sodium citrate와 9:1의 비율로 섞었다. 이를 Lian $들^{5)}$ 의 방법으로 22℃에서 180g에서 10분간 원심분리(Beckman TJ-60, USA)하여 상충액에서 혈소판 풍부 혈장(platelets rich plasma, 이하 4PRP)을 얻었다. 이 PRP를 끝이 뾰쪽한 시험관에 넣은 후 20%의 사람 혈청 알부민(녹십자)을 1/20 비율로 넣고 22℃에서 1650g로 15분간 원심분리 하였다. 침전된 혈소판을 약 20배 용량의 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4, 0.15 M NaCl 포함; 이하 TBS)으로 희석하고 전술한 방법으로 알부민을 넣어 3회 세척하였다. 세척된 혈소판은 자동 혈구 계산기 (Coulter counter, UK)로 수를 측정하고 TBS로 ㎕당 75만개가 되도록 조절하여 혈소판 응집 측정에 사용하였다.5) 혈소판 응집반응의 측정 혈소판 응집반응은 혈소판 응집 측정기에 30분간 전원을 넣어둔 다음 609 nm의 적색 필터를 사용하여 측정하였다. PRP 400 ㎕를 실리콘 처리된 측정 용기에 넣고 대조로는 TBS를 500 ㎕ 넣었다. PRP를 회전하는 소형 자석 막대가 들어 있는 상태에서 37℃로 가온시킨 후, 측정하고자 하는 시료 100 ㎕를 넣어서 흡광도를 15분간 측정하여 기록하였다.6) SDS-polyacrylamide 겔 전기영동 SDS-polyacrylamide slab 겔 전기영동 (이하 SDS-PAGE)은 Laemmli의 방법으로 하였$다^{9)}$. 5%의 농축용 겔과 10% 혹은 l2%의 분리용 겔을 사용하였으며 전기 영동 완료 후에는 Coomassie blue R-250으로 겔을 염색하였다. 분자량을 측정하기 위하여 bovine serum albumin 66,000 Da, egg albumill 45,000 Da, carbonic anhydrase 29,000 Da, soybean trypsin inhibitor 20,100 Da 및 α-lactalbumin 14,200 Da을 표준 물질로 사용하였다. 한편 periodic acid-Schiff's reagent (이하 PAS) 염색을 실시하여 당단백질의 유무를 조사하였$다^{10)}$. 7) 단백질 농도의 측정 단백질 농도는 표준 물질로서 bovine serum albumin을 사용하여 Bradford의 방법으로 측정하였$다^{11)}$ 분리 정제시 이용한 크로마토그라피에서의 흡광도는 280 nm의 파장에서 측정하였다. 8) 황산 암모니움 침전 분리 동결건조한 TTP 환자의 혈장을 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH7.4)에 넣고 천천히 녹인 후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상등액에 고체 분말 상태의 황산 암모니움을 4℃에서 50% 포화용액이 되도록 천천히 첨가하여 30분간 잘 섞어 주었다. 30분간 방치한 후 10,000xg에서 원심분리하여 얻어진 침전물을 적당량의 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)으로 잘 녹여준 후, 같은 완충액으로 투석하였다. 투석 후의 현탁액을 다시 10,000xg로 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 다음 분리과정에 사용하였다.9) DEAE-Sephacel 크로마토그라DEAE-Sephacel (2.3×9.0 cm)을 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)으로 평형화시킨 다음, 시료를 컬럼에 주입하고 동일 완충액으로 280nm의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 세척하였다. 세척 후 0.2 M 혹은 0.3 M NaCl를 함유한 같은 완충액으로 용출하였다. 용출된 시료는 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4, 0.5 M NaCl, 1 mM $CaCl_2$, 1 mM $MnCl_2$포함)으로 투석한 후 농축하여 다음 분리과정에 사용하였다.10) Con A-Sepharose 크로마토그라피20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4, 0.5 M NaCl, 1 mM $CaCl_2,/;1mM/;MnCl_2$포함)으로 투석한 후 Con A-Sepharose 분리관 (1.3×9.0 cm)에 주입하고 동일 완충액으로 흡광도가 280 nm에서 거의 0이 될 때까지 세척하였다. 용출은 α-methyl-D-glucoside (0-0.5 M)의 직선 농도차로 수행하였다. 이후 계단식으로 0.5 M과 1.0 M의 α-methyl-D-glucoside 로 용출하였고, 마지막 분획은 0.1 M acetate 완충액 (pH 4, 0.5 M NaCl 포함)으로 용출하였다.11) Superose 12 겔-여과 크로마토그라피 TBS 완충액으로 투석한 후 얻어진 시료는 FPLC의 Superose 12 분리관에 주입하고 동일 완충액으로 겔여과를 수행하였다. 용출 속도를 0.3 ㎖/min으로 하였으며 0.15 ㎖씩 분획 수집하였다. 각 분획에 대하여 혈소판 응집능을 조사하였다.12) Sedimentation coefficient 의 결정 Analytical ultracentrifuge XL-80 (Beckmann Co.) 을 사용하여 분리 정제된 혈소판 응집 단백질의 sedimentation coefficient를 결정하였다. 40,000 rpm에서 원심분리하였으며 230 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.13) 혈소판 응집단백질의 결합 혹은 저해능 측정 Thrombin 의 antibody에 대한 혈소판 응집 단백질의 결합 능력을 thrombin과 동시에 농도별로 결합 활성과 anti-goat antibody-HRP을 이용한 저해능력을 비교 측정하였다.14) 당쇄구조의 분석 HAse 방법을 이용하여 혈소판 응집 단백질의 당쇄 부분의 구조를 분석하였다. 혈소판 응집 단백질의 당쇄 부분을 pyridylamination 시키고 여기에 형광 물질을 도입하여 유도체를 만들어 이미 알려진 thrombin 의 당쇄구조와 비교하였다.

Abstract ▼

The following experiments were carried out in order to purified the platelet agglutinating protein from the plasma.1) Purification of PAP from the plasmaThe platelet aggulutinating protein (PAP) was purified from the plasma which was obtained during the plasmapheresis in a Korean patient with TTP.2)

The following experiments were carried out in order to purified the platelet agglutinating protein from the plasma.1) Purification of PAP from the plasmaThe platelet aggulutinating protein (PAP) was purified from the plasma which was obtained during the plasmapheresis in a Korean patient with TTP.2) Biochemical property of Platelet-Agglutinating Protein characterized3) Collection of plasma from TTP patientThe two liters of plasma obtained from plasma- phoresis was freeze-dried immediately.4) Preparation of platelet soluionPlatlet was obtained from the forearm vein man whose blood type was O type and mixed with 3.8 % sodium citrate in a ratio of 9:1. We were obtained the supernatant which have platelet rich plasma(PRP) after centrifugation at 180xg for 10 min at 22'C. After putting the PRP into a cornical tube, 20 % of human serum albumin was added in a ration of 1:20 and then centrifuged at 1650xg for 15 min at 22'C. Pelleted platelet was diluted with 20 times volume of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 0.15 M NaCl(TBS) and washed three times after adding human serum albumin according to the method described above. The number of washed platelet was counted using an automatic blood cell counter and counted platlet was diluted with TBS to use 75 milliom blood cells per microliter in the platelet agglutination tests.5) Assay of platelet agglutinaing activityThe platelet agglutinating test were carried out at 609 nm after 30 min turn on the agglugometer. Absorbance was measured for 15 min at 37'C after 400 ul of PRP and 100 ul of sample was stirred6) SDS-Polyacrylamide gel electrophoresisSDS-polyacrylamide slab gel electrophoresis was performed according to $Laemmli^{9)}$. 5% stacking gel and 10% or 12% separating gel were used and gels were stained using Coomassie blue R-250. 66,000 Da bovine serum albumin, 45,000 Da egg albumin, 29,000 Da carbonic anhydrase, 21,000 Da soybean trypsin inhibitor and 14,200 Da α-lactoalbumin were used as standards. In order to investigate the presence of glycoprotein, periodic acid-schiff's reagent (PAS) was used as a staining reagent.7) Measurement of protein concentrationProtein concentration was measured by Bradford's $method^{11)}$ using bovine serum albumin as a standard protein. Absorbance at 280nm was used during column chromatograpy for protein purification.8) 50 % ammonium sulfate precipitationLyophilized TTP patient plasma was dissolved in 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, and centrifugated for discard the pellet. In order to obtain the protein ammonium sulfate was added slowly at 4'C. The 50 % satulated solution was stirred for 30 min and kept for 30 min. The protein obtained from centrifugation at 10,000xg was dissolved in 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 and dialyzed against the same buffer. The dialyzed solution was centrifugated at 10,000xg for 20 min and the supernatant was used the next protein purification steps.9) DEAE-Sephacel column chromatographyThe sample was loaded on DEAE-Sephacel columnm (2.3×9.0 cm) which was equilibrated with 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 and washed with the same buffer until the absorbance at 280nm became zero. The same buffer containing 0.2M or 0.3M NaCl was used to elute the desired protein pool. The eluted fraction was dialyzed against 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 0.5M NaCl, 1mM $CaCl_2,/;1mM/;MnCl_2$and ultrafiltrated to use in the next protein purification steps.10) Con A-Sepharose column chromatographyAfter dialysis against 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 0.5M NaCl, 1mM $CaCl_2,/; 1mM/; MnCl_2$, the ultrafiltrated fraction was loaded on Con A-Sepharose column (1.3×9.0 cm) and washed with the same buffer until the absorbance at 280nm became zero. The elution was carried out using linear gradient of 0 to 0.5M α-methyl D-glucoside. Then, the elution was performed again with 0.5M and 1.OM α-methyl D-glucoside and the last fraction was eluted with 0.1M acetate buffer, pH 4 containing 0.5M NaCl. 11) Superose 12 gel filtration column chromatographyThe fraction obtained after dialysis against TBS buffer was loaded on FPLC superose 12 gel filtration column and carried out with the same buffer. The flow rate was 0.3ml per min and the fraction size was 0.15m1. Every fraction was tested to platelet agglutinating activity.12) Determination of sedimentation coefficientThe sedimentation coefficient of Platlet Agglutinating Protein was caculated by analytical ultracentrifuge XL-80 (Beckmann Co.) at 40,000 rpm, 20'C.13) Binding and inhibition assay of PAPThe binding and inhibitory activity test were carried out with the antibody or anti-goat antibody of thrombin on ELISA test.14) Analysis of Sugar chain on PAPWe were detected the sugar chain of PAP using the pyridylamination of sugar chain as Hase method which is a sensitive method for analysis of sugar chain from glycoprotein.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...22
• 제 2 장 실험재로 및 방법...26
• 제 1 절 실험재료...26
• 1. 대상...26
• 2. 재료...26
• 제 2 절 실험방법...26
• 1. TTP 환자 혈장의 수집...26
• 2. 세척 혈소판 수용액의 준비...27
• 3. 혈소판 응집반응의 측정...27
• 4. SDS-polyacrylamide 겔 전기영동...28
• 5. 단백질 농도의 측정...28
• 6. 황산 암모니움 침전 분리...29
• 7. DEAE-Sephacel 크로마토그라피...29
• 8. Con A-Sepharose 크로마토그라피...30
• 9. Superose 12 겔-여과 크로마토그라피...30
• 제 3 장 실험결과 및 고찰...31
• 제 1 절 혈소판 응집 단백질의 분리...31
• 제 2 절 혈소판 응집 단백질의 특성 비교...35
• 제 4 장 결 론...44
• 제 5 장 요 약...45
• 참고 문헌...47