초록 ▼

아데노 부속 바이러스의 p40 promoter 유전자 발현조절부위에 결합하는 세포전사조절인자 major late transcription factor (MLTF)의 기능을 Rep gene과 함께 조사하였으며 Rep gene과 아데노바이러스의 발암성 유전자 EIA와의 기능적 상호작용을 알아보기 위하여 아데노바이러스 early gene promoter들의 활성을 Rep gene과 EIA gene 존재 유무하에서 조사하였다. Rep gene의 EIA에 대한 길항적 작용, AAV replication, transcription, integ

아데노 부속 바이러스의 p40 promoter 유전자 발현조절부위에 결합하는 세포전사조절인자 major late transcription factor (MLTF)의 기능을 Rep gene과 함께 조사하였으며 Rep gene과 아데노바이러스의 발암성 유전자 EIA와의 기능적 상호작용을 알아보기 위하여 아데노바이러스 early gene promoter들의 활성을 Rep gene과 EIA gene 존재 유무하에서 조사하였다. Rep gene의 EIA에 대한 길항적 작용, AAV replication, transcription, integration/excision 및 oncosuppression 활성에서 중요할 수 있는 세포내 mediator의 탐색을 시도하였다.Rep 68 단백질은 AAV p5 및 p19 promoter에 염기서열 특이적으로 결합함이 보고되었다. p40 promoter에는 p5 promoter의 Rep68 결합부위의 염기서열과 homology가 있는 부위가 발견되고 있으나, Rep78/68 단백질이 p40 promoter에 염기서열 특이적으로 결합하는지는 아직 밝혀지지 않고 있다. 아데노바이러스와 AAV로 감염시킨 HeLa 세포핵 추출물에서 MLTF 결합부위에 MLTF가 결합함을 보고하였다. p40 promoter에서 MLTF의 기능을 알아보기 위하여 4종류의 MLTf 결합부위 mutant를 제조하였다. MLTF mutant들은 Rep gene 존재하에서 야생주와 비교할 때 p40 전사량에 큰 차이를 보여주지 않았고 Rep gene이 존재하지 않았을때 p40 전사량에 차이가 있음을 보여 주었다. Rep gene이 존재하지 않았을때 야생주의 p40 전사량은 mutant에 비해 적었다. 이결과로 Rep gene은 p40 전사 활성화에 관여하며 p40 전사가 일어날 때 Rep 단백질의 세포내 mediator중의 하나는 MLTF일 것으로 추정할 수 있었다.아데노바이러스 EIA 유전자는 DNA tumor virus의 tumorigenesis를 연구하는데 좋은 모델이 되고 있다. 발암성 유전자 EIA에 의한 정상세포의 암화기전은 EIA 단백질과 tumor suppressor 단백질 Rb 및 세포주기 조절인자 cyclin A와 같은 단백질 단백질 상호작용과 세포유전자 발현조절의 이상화를 통하여 일어날 수 있다. 또한 아데노바이러스는 AAV의 증식에 helper virus로서의 기능을 갖고 있지만 AAV는 아데노바이러스의 증식과 암화를 억제한다. Rep gene과 EIA의 상호작용을 알아볼 목적으로 EIA에 의해 영향을 받고 있는 아데노바이러스 early gene들의 활성을 EIA와 Rep gene 존재하에서 조사하였다. Rep gene은 아데노바이러스의 EIA promoter를 농도의존적으로 활성화시키고 repression 시켰으며 EIB, E3 및 E4 promoter 의 basal activity를 repression시켰다. E2 promoter 의 basal activity는 rep gene에 의해 repression되지 않았으며 오히려 약간의 활성화를 유도하였다. EIA 유전자는 이미 보고된바와 같이 EIA, EIB, E2, E3, E4 promoter를 모두 활성화시켰으며 rep gene 이 존재하였을 때 EIA에 의한 promoter의 전사활성화는 repression받았다. 이결과는 AAV 증식과 관련된 아데노바이러스 유전자의 발현을 조절하는 promoter의 활성을 rep gene이 농도의존적으로 조절하여 다량의 rep gene이 존재하였을 때 EIA에 대한 antagonist로서 rep gene이 작용하여 아데노바이러스의 증식과 암화를 억제할 수 있다는 것을 암시해 주고 있다.EIA는 세포내 여러 단백질들과 특이적인 단백질 단백질 상호작용을 하며 염기서열 특이적인 DNA 결합단백질이 아니고 rep gene 또한 아데노바이러스 early gene promoter 에 염기서열 특이적인 결합을 한다고 보고된바 없으므로 EIA와 Rep gene의 상반된 작용은 세포내 mediator를 통하여 일어나는 것으로 볼 수 있다. Rep gene의 세포내 mediator를 탐색하기 위하여 효모의 two hybrid system을 이용하고 있다. 2차 screening한결과 Rep52 단백질과 상호작용할 것으로 추정되는 21개의 클론을 Human cDNA library에서 확인하여 이들의 특성을 규명하고 있다.

Abstract ▼

We investigated the function of major late transcription factor (MLTE＼F) on the AAV p40 promoter and the rep gene effect on the adenovirus early gene promoters in the presence and absence of EIA gene to know the functional correlation between oncogene EIA and the rep gene of AAV. In addition, we hav

We investigated the function of major late transcription factor (MLTE＼F) on the AAV p40 promoter and the rep gene effect on the adenovirus early gene promoters in the presence and absence of EIA gene to know the functional correlation between oncogene EIA and the rep gene of AAV. In addition, we have been looking for cellular factor(s) that might interact with Rep protein which plays an important role in AAV replication, transcription, integration/excision and oncosuppression. Rep68 has been shown to bind the transcription control region of p5 promoter sequence-specifically. There are two potential Rep78/68 binding-site in the transcription control region of p4O promoter. These seouences are homologous to Rep68 binding sequence in p5 promoter. Rep protein binding to the p40 promoter remains yet to be verified. We reported that protein extacts of nuclei prepared from HeLa cells infected with adenovirus and AAV contained a cellular transcription factor, MLTF, that bound to p5 and p40 promoter of AAV. To know the function of MLTF on p40 transcription, four different kinds of mutants at MLTF binding-site were constructed and the amounts of p40 transcripts in the total RNA from HeLa cells transfected with wild type and the mutants plasmid were measured by primer-extension analysis. We found no difference in the amounts of p40 transcript between the wild type and each mutant in the presence of the rep gene. However, in the absence of the rep gene were there differences in the amounts of p40 transcript between the wild type and the MLTF mutants. This results suggest that the rep gene may activate p40 promoter in trans and the transactivation of the rep gene may occur at least partially through MLTF on p40 promoter.EIA gene of adenovirus has been a valuable tool to study tumorigenesis by DNA tumor virus. The molecular events of EIA protein that induces transformation of mammalian cells in tissue culture can now be explained by inactivation of tumor suppressor gene and cell cycle pertubation through protein-protein interaction such as EIA-Rb and EIA-cyclinA. Adenovirus as helper virus functions for the lytic cycle of AAV, but AAV inhibits growth of adenovirus and transformation by adenovirus in rodents. To know the molecular mechanism of the AAV, specially, the rep gene on the growth of adenovirus and on the cellular transformation by EIA, we have looked into the rep gene effect on the adenovirus early gene promoters such as EIA, E1B, E2, E3 and E4. These promoters have been shown to be affected by E1A gene. Thus, this can be a good model system to elucidate functional interaction between the rep gene and the E1A gene at molecular level, The rep gene activated and repressed E1A promoter depending on the amounts of the rep gene and repressed the basal activity of E1B, E3 and E4 promoter. The activity of E2 promoter was slightly activated by the rep gene. The E1A gene activated all the promoters as reported previously. The transacivation of these promoters by E1A was not observed in the presence of the rep gene. These results suggest that the rep gene controls the promoters of adenovirus depending on the concentration of Rep and E1A protein. The fact that the rep gene works as functional antagonist against the E1A gene may explain how AAV inhibits the growth of adenovirus and the celluiar transformation by adenovirus. The facts that E1A is not a sequence-specific DNA binding protein and functions through interaction with cellular protein(s) and the rep gene has not been shown to bind to the adenoviral promoters sequence-specifically suggest that there may be cellular factor(s) mediating interaction between the rep and the E1A gene. Therefore we have been using yeast two hybrid system which has been powerful tool to look for specific protein-protein interaction. pGBT/rep52 plasmid as bait vector and human liver cDNA library have been used to search for cellular counterpart(s) with which Rep protein might interact.After second screening, we have found 21 clones which were positive in color reaction, indicating protein-protein interaction.

목차 Contents

• 1. 서론...17
• 2. 실험재료 및 방법...22
• 3. 실험결과...28
• 4. 고찰...39
• 5.참고문헌...46