초록 ▼

효모를 숙주세포로 이용한 유전자발현 및 분비 시스템을 사용하여 재조합단백질을 고효율로 생산하는데 있어서 주요한 요인중의 하나인 단백질 분비시그널을 개량하기 위하여 prepro 를 모두 함유하는 signal sequence 와 pre 만을 함유하는 2종류의 분비시그널을 사용하여 단백질 분비속도와 효율을 비교조사함으로써 분비시그널의 processing 에 관여하는 protease KEX2 에 대한 의존성이 분비효율에 미치는 영향을 알아보았다. 또한 고농도 세포배양시에 특히 문제가 되는 용존산소 이용효율을 높일 수 있도록 Vitreosc

효모를 숙주세포로 이용한 유전자발현 및 분비 시스템을 사용하여 재조합단백질을 고효율로 생산하는데 있어서 주요한 요인중의 하나인 단백질 분비시그널을 개량하기 위하여 prepro 를 모두 함유하는 signal sequence 와 pre 만을 함유하는 2종류의 분비시그널을 사용하여 단백질 분비속도와 효율을 비교조사함으로써 분비시그널의 processing 에 관여하는 protease KEX2 에 대한 의존성이 분비효율에 미치는 영향을 알아보았다. 또한 고농도 세포배양시에 특히 문제가 되는 용존산소 이용효율을 높일 수 있도록 Vitreoscilla 유래의 hemoglobin(VHb) 유전자를 재조합 효모에 도입하여 산소담체를 발현시켜 재조합단백질 생산의 효율성을 증가시킬 수 있는 가능성을 조사하였다. 이를 위하여 목표유전자로서 의약용 재조합단백질로서 개발되고 있는 거머리 유래의 항혈전단백질인 hirudin 과 인체 표피성장인자(human epdermal growth factor, EGF) 를 선정하였고 본연구팀에서 개발하여 기보유하고 있는 유전자발현 및 분비 시스템을 사용하였다. 전통적으로 가장 많이 사용되고 있는 효모 Saccahromyces cerevisiae 와 최근 고효율 재조합단백질 생산에 각광을 받고 있는 비전통효모 Hansenula polymorpha 의 유전자 발현분비 카세트를 도입하여 제조된 생산 균주를 대상으로 2종류의 분비시그널의 비교와 VHb 유전자의 발현이 미치는 영향을 조사하였다. 재조합단백질 분비시그널은 현재 가장 많이 사용되고 있는 분비 시그널 MFα Prepro Leader (ppL) sequence 의 prepro region 전체를 사용하여 생산균주를 제조하였으며 Killer Toxin signal sequence 의 pre sequence 만을 함유하는 분비시그널로 대체하였을 때의 재조합단백질 분비 효율과 분비 속도를 비교하였다. VHb 유전자를 위에서 제조한 생산균주에 도입하여 발현시키기 위하여 Saccahromyces cerevisiae 균주의 경우 episomal state 로 유지되는 vector 의 양방향 전사 promoter 인 GAL1-GAL10 promoter 의 GAL1 방향에 cloning 하였고 Hansenula polymorpha의 경우 목표유전자가 이미 chromosome에 integration 되어 있는 생산균주에 VHb를 도입하기 위하여 발현 vector 에 VHb 유전자를 cloning 하고 이를 다시 chromosome 에 integration 하여 산소담체 발현이 전반적인 유전자발현에 미치는 영향을 검정하였다.

Abstract ▼

Two gene expression systems were developed using Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha as hosts for the productions of the recombinant anticoagulant hirudin and the human epidermal growth factor(hEGF). Chemically synthesized genes based on the reported amino acid sequence of hirudin and

Two gene expression systems were developed using Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha as hosts for the productions of the recombinant anticoagulant hirudin and the human epidermal growth factor(hEGF). Chemically synthesized genes based on the reported amino acid sequence of hirudin and hEGF were cloned into the expression and secretion vectors of S. cerevisiae and H. polymorpha, respectively. Hirudin gene was under the controls of galactose inducible promoter, GAL10 and pre-pro leader sequence of mating factor α of S. cerevisise. Biologically active hirudin was found in the culture supernatant of recombinant S. cerevisiae containing the hirudin expression cassette. After modification of expression cassette and optimization of culture conditions, the yield of hirudin was increased up to 0.5 g/L in the fermentor. hEGF expression cassette was constructed under the control of MOX promoter and pre-pro leader of S. cerevisiae. The expression vectors were transformed into the H. polymorpha. Intensive screening of high EGF producing strain was made and a strain which produced hEGF upto 1.1 g/L in the fermentor was obtained. To select the efficient secretion signal for the increased secretion level of recombinant protein in the yeast, two well-known secretion signal, pre-pro leader of mating factor α of S. cerevisiae and secretion signal of killer toxin from Kluyveromyces lactis were tested for their efficacy for the secretion of hirudin and hEGF in S. cerevisiae and H. ploymorpha, respectively. In every case, killer signal showed higher level of secretion than pre-pro leader. Higher level of secretion and prolonged secretion of hirudin during the stationary phase of culture was noted especially in the culture of S. cerevisiae for the production of hirudin The expression of Vitreoscilla hemoglobin(VHb) gene of Vitreoscilla stercoraria was known to be induced when the dissoloved oxygen was decreased in the culture environment. This mode of expression of VHb was shown to be functional in other prokaryotes. VHb has been successfully employed, especially in prokaryotes, for the improved production of recombinant production and the secondary metabolites. The net effect of VHb for the increased performance in the processes where high level of oxygen demand were notable has been shown to be caused by the maintenance of the more oxidized state in the cell. The effect of VHb on the recombinant protein production in the gene expression systems of yeasts was studied in this study. For the recombinant hirudin production strain of S. cerevisiae described above, the VHb gene was inserted in the expression cassette under the GAL1 promoter. For EGF production strain of H. polymorpha, VHb gene was cloned in the expression cassette under the MOX promoter and integrated in a single copy into the chromosome of the host strain. The resulting transformants expressing VHb in addition to the desired recombinant proteins, hirudin and EGF, were compared with the control strain in shake flask cultivation with respect to their growth rate and recombinant protein production. In S. cerevisiae strain producing hirudin, the expression of VHb gene showed a considerable negative effect both on the cell growth and on the hirudin production probably due to the fact that an additional gene, VHb shared the same promoter resulting in the decreased expression of hirudin gene. The other possibility was that the overexpression of VHb gene which located on the multicopy plasmid. To circumvent the undesirable effect described above, different approach has been made in the case of H. polymorpha strain producing EGF. The VHb gene was cloned in a separate vector and integrated into the chromosome of the host in a single copy. The resulting integrant showed higher(upto 1.8 fold) production level of EGF compared with the control strain. This increase in the production level was more prominant in the case of less aerated cultures compared with a well aerated shake cultures as may be expected from the mode of action of VHb.

목차 Contents

• 제1장 서 론...19
• 제1절 사업의 필요성...19
• 제2절 사업의 목표 및 내용...20
• 제2장 국내외 기술개발 현황...21
• 제1절 재조합효모를 이용한 이종단백질 생산...21
• 제2절 목표유전자...23
• 제3절 재조합 효모의 유전자발현분비 시스템의 개량...26
• 제4절 Vitreoscilla Hemoglobin (VHb)...27
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...30
• 제1절 목표유전자 hirudin 및 EGF 발현을 위한 발현분비 카세트와 생산균주의 제조...30
• 가. Hirudin 발현 vector의 제조...30
• 나. EGF 발현 vector의 제조...32
• 다. 재조합 히루딘 생산 효모 S. cerevisiae 균주 제조...37
• 라. 재조합 EGF 생산 메타놀 자화효모 H. polymorpha 균주 제조...39
• 제2절 재조합단백질 분비 시그널의 개량...42
• 가. S.cerevisiae에서의 hirudin 분비 시그널의 개량...42
• 나. H.polymorpha에서의 hEGF 분비 시그널의 개량...48
• 제3절 Vitreoscilla Hemoglobin (VHb)의 목표유전자 발현에 대한 효과...53
• 가. Hirudin 생산균주 S. cerevisiae 에서의 VHb 유전자 발현의 영향...57
• 나. EGF 생산규주 H. polymorpha 에서의 VHb 유전자 발현의 영향...59
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...64
• 제1절 목표유전자 hirudin 및 EGF 발현을 위한 발현분비 카세트와 생산균주의 제조...64
• 가. 재조합 hirudin 생산 효모 S. cerevisiae...64
• 나. 재조합 인체 EGF생산 효모 H. polymorpha...64
• 제2절 재조합단백질 분비 시그널의 개량...65
• 제3절 Vitreoscilla Hemoglobin (VHb)의 목표유전자 발현에 대한 효과...66
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...67
• 제6장 참고문헌...68