초록 ▼

Ⅰ. 제 목 대두단백질로부터 단위단백질의 순수분리와 단백분해효소에 대한 분해패턴 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 대두단백질로부터 기능성 펩타이드를 탐색제조하기 위하여 구성단위 단백질로 순수분리하고 기질특이성이 다른 여러 가지 단백분해효소에 대한 분해 패턴을 보아 기능성펩타이드를 제조하는 데 기초자료로 활용하고자 한다. 대두단백질이나 난황단백질의 분해산물로부터 여러 기능성 펩타이드가 있는 것으로 알려져 있으나 구체적인 구조는 대부분 알려지지 않았으며, 구조가 기 알려진 기능성 펩타이드에 대한 생산

Ⅰ. 제 목 대두단백질로부터 단위단백질의 순수분리와 단백분해효소에 대한 분해패턴 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 대두단백질로부터 기능성 펩타이드를 탐색제조하기 위하여 구성단위 단백질로 순수분리하고 기질특이성이 다른 여러 가지 단백분해효소에 대한 분해 패턴을 보아 기능성펩타이드를 제조하는 데 기초자료로 활용하고자 한다. 대두단백질이나 난황단백질의 분해산물로부터 여러 기능성 펩타이드가 있는 것으로 알려져 있으나 구체적인 구조는 대부분 알려지지 않았으며, 구조가 기 알려진 기능성 펩타이드에 대한 생산 방법이 지극히 알려지지 않아 대량생산하는 데 걸림돌이 되고 있다. 현재 대두유 및 두유 생산공장에서는 많은 량의 대두박과 두유박이 생산되나 10% 정도만 식용으로 이용되고 90%이상이 폐기되거나 약간 동물사료로 쓰이고 있어서 활용도가 떨어져 주요한 자원을 그대로 폐기하는 형편이다. 난황으로부터 레시틴이 상업적으로 생산하는 공장이 가동되어 하루 몇 톤단위의 난황단백질이 폐기부산물로 생산되나 거의 폐기되거나 싼값으로 일본에 수출되고 있다. 따라서 이를 고부가가치화 하려면 기초적으로 단위단백질을 순수 분리하여야 하고 이들에 대한 분자구조를 어느 정도까지 (monomer 또는 complex) 알아야 하며, 반드시 protease 분해패턴을 연구함으로 기능성 펩타이드 생산정보를 알 수 있으므로 궁극적으로 생산단가를 낮출 수 있는 길이 열린다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1. 대두 단백질의 순수분리와 분해패턴 연구 가) 대두단백질의 단위단백질별 순수 분리와 1차구조 분석 Column 등을 이용하여 대두단백질의 7S와 11S를 분자량차이에 의하여 순수분리를 시도하고, 분리한 단위단백질을 circular dichroism (CD)나 protein sequenator 등을 이용하여 1차 또는 2차구조를 분석하였다. 나) 단위단백질의 기능특성과 기능성 개선 연구 용해도를 중심으로 물리화학적인 기능성을 여러 가지 방법에서 측정하 고 아울러 이의 증진방법을 연구하였다. 다) 단위 단백질의 프로테아제의한 펩타이드 분해패턴의 연구 분리한 단위 펩타이드를 이용하여 각종 단백분해효소에 의한 단백질 의 분해패턴을 연구하고 각종 기능성 펩타이드의 생산 가능성 연구를 하여 생성과정을 추적하였다. 2. 난황단백질의 물리화학 기능성 증진 연구 난황단백질의 성분분석을 수행하고 단백질의 물리기능성인 용해도, 유화 생성능력, 거품형성능을 조사하여 이의 식품에 활용하는 데 자료로 활용 할 수 있는 자료를 얻었다. Ⅳ. 연구개발결과 1. 대두 단백질의 순수분리와 분해패턴 연구 가. 대두단백질의 단위단백질별 순수 분리와 1차구조 분석 Sephadex column chromatography, Sepharose 6B chromatography, Concanavalin Agarose chromatography를 이용하여 순도가 95% 이상 되게 분리하였다. Purity는 SDS gel electrophoresis와 HPLC로 확인하였다. 라이신잔기를 적당량의 acetic anhydride를 이용하여 28%, 45%, 65%, 95%로 아세틸화 시켰다. 단백질의 기능적 특성에 특히 중요한 물리화학적 성질인 우연성(flexibility)은 자연 상태의 단백질에 있어서는 80정도였으나, 아세틸화가 95% 일어난 단백질에 있어서는 180으로 2배 이상 증가하였으며, 유연성은 유연성과 역관계에 있는 엔탈피를 측정한 결과 자연상태의 단백질에서는 3.5cal/g 단백질에서 65% 아세틸화 이상의 단백질의 경우에는 0 cal/g으로 유연성이 급속히 증가함을 알 수 있었다. Circular dichroism의 결과 아세틸화에 의해 단백질의 β-형태가 감소하고 풀린 형태가 증가하여 나타나는 현상임을 알탁도는 pH 5.5에서 최대였으며 pH 8 이상과 pH 3 이하에서는 혼탁도의 현저한 감소가 나타났다. 단백질간의 응집의 주된 힘이 수소결합임이 밝혀졌다. NaCl은 자연상태의 glycinin의 혼탁도를 낮추었으며 칼슘은 pH 6이상에서 자연상태의 단백질에 있는 이미다졸기와 반응하여 혼탁도를 유발하였다. 한편 자연상태의 단백질은 80℃에서 3분간 가열처리에 의해 급속히 혼탁 되었는데 conglycinin를 첨가할 경우 열안정성을 보였다. 에멀션화에 관한 실험실에 의해 아세틸화가 이루어진 glycinin은 자연상태의 glycinin에 비해 등전점 이상의 pH에서는 보다 높은 활성도를 나타냈는데 이는 아세틸화에 의해 단백질의 표면 소수성과 유연성이 증대되었기 때문이다. 그러나 등전점 이하에서는 자연상태의 단백질의 아세틸화된 단백질에 비해 상대적으로 높은 에멀션 활성도를 나타내었으며, 이는 자연상태의 glycinin이 이 구간에서는 보다 높은 용해도를 나타내었기 때문이라 생각된다. 아세틸화 glycinin에 의해 생성된 에멀션은 자연상태의 glycinin에 의해 형성된 에멀션에 비해 현저히 높은 안정도를 보였다. 아세틸화에 의해 glycinin의 의해 생성된 에멀션은 자연상태의 glycinin에 의해 형성된 에멀션에 비해 현저히 높은 안정도를 보였다. 아세틸화에 의해 glycinin의 음이온이 상대적으로 증가하여 정전기적인 반발력의 증가와 수성계의 점도 증가에 의해, 기름 방울간의 모임이 억제되어 에멀션의 안정도가 증대되었다고 생각된다. 갈변화반응은 아세틸화가 일어난 glycinin 일수록 적게 일어났으며 따서 용해도의 감소 역시 자연상태의 단백질에 비해 적었다. 따라서 에멀션 활성도의 감소는 아세틸화가 일어난 glycinin이 가장 적었으며, 자연상태의 단백질이 가장 컸다. 이상에서 본바와 같이, glycinin에 대한 아세틸화에 의해 glycinin의 구조는 급속히 변성되었으며, 특히 65% 이상에서는 그 변화 쪽이 급격히 이루어졌다. 다. 단위 단백질의 프로테아제의한 펩타이드 분해패턴의 연구 Whole protein의 가수분해 패턴은 먼저 조사하였다. Glycinin(11S), conglycinin(7S), whey protein, 2S, 5S 등으로 구성된 whole protein을 API 또는 trypsin으로 가수분해시켰을 때의 분해패턴과 API로 가수분해 시켰을 때의 비교하였다. API로 가수분해시켰을 때 분해물의 분획가능한 peptide는 7개 검출되었으며 Lys-과 Arg-C를 가수분해하는 효소 trypsin으로 가수분해했을 경우는 9개인 것으로 나타났다. 부분정제된 conglycinin을 API 또는 trypsin으로 가수분해시켰을 때의 분해패턴은 peptide 10개 정도로 나타났으며 trypsin처리의 경우 역시 10개 정도인 것으로 나타났다. Intact protein의 함량이 trypsin의 경우가 많은 것은 trypsin의 가수분해활성이 API보다 5배 정도 낮은 결과로 생각되며 효소: 기질의 비율을 1:100 이상의 비율로 효소를 첨가한 경우도 intact protein의 함량이 줄지 않았는데 이것은 conglycinin의 분자구조가 folding을 이루고 있기 때문인 것으로 생각된다. 정제된 glycinin을 API으로 가수분해하였을 경우의 분획 가능한 peptide는 18개 정도로 나타났으며 trypsin처리의 경우 lysine을 포함해 arginine까지 절단하여 peak는 API 보다 더욱 세분화되었으며 분획 가능한 peak 수는 20개 정도인 것으로 나타났다. API 또는 trypsin으로 완전 가수분해 가능한 것으로 나타났다. 2. 난황단백질의 물리화학 기능성 증진 연구 난황단백질의 물리기능성인 용해도, 유화생성능력, 거품형성능을 조사하였다. 그 결과 식품으로 사용하기에는 물리적인 기능성을 증진시킬 필요가 있는 것으로 나타났다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 ᄋ 기능성 펩타이드 생산경로 추적에 의한 대량생산 가능성 모색 ᄋ 기초기술 연구로 해외유명잡지에 논문 게제로 한국식품개발연구른 응용연구

Abstract ▼

To apply the soy protein for making high value added products, the physical properties of soy protein was studied and methods to improve the physical properties such as solubility was investigated. Also physical properties of egg yolk proteins were also studied. To get the informations of proteins,

To apply the soy protein for making high value added products, the physical properties of soy protein was studied and methods to improve the physical properties such as solubility was investigated. Also physical properties of egg yolk proteins were also studied. To get the informations of proteins, soy proteins were separated into glycinin (11S) and conglycinin (7S) by sedimentation and using column chromatography, and hydrolysis patterns by protease were analyzed by HPLC for production of nutraceutical peptides in soy protein. Glycinin was used as the model protein, partly due to ease of availability in large quantity, wide usage as local food ingredient such as tofu (Dooboo) and soymilk, implicating ease in acceptance, and some interesting functionality which inhibit wider applications in food industries. In this work, following important conclusion were obtained. On physicochemical properties : Enthalpy, as obtained from differential scanning calorimetry, dropped from 3.6 cal/g native protein to 0 cal/g protein when lysine residues were acetylated above 65%, implicating complete denaturation. On turbidity of the protein : Isoelectric point of glycinin was found to be around pH 5.5. Adding of NaCl markedly decreased turbidity of native glycinin. The effect of CaCl2 on the aggregation of the protein was somewhat different from NaCl. No significant changes in aggregation were observed upon the addition of CaCl2 to the solution of native glycinin at pH range from 3 to 6, but above pH 6 glycinin was notably aggregated. Heating of protein solution containing CaCl2 over various pH did not affect aggregation pattern of native glycinin. Thermostability of native protein was improved by conglycinin especially around pH 7. On emulsifying properties : Emulsifying properties of acetylated glycinin was also checked using samples of 0%, 45%, and 90%. At oil to protein solution ratio of 2.5:7, pH 7.6, 90% acetylated glycinin over 70% increase in emulsifying activity over native protein. Increase in surface hydrophobicity, flexibility, and solubility account for the improvement. At above isoelectric point of the protein, emulsifying properties of acetylated glycinin was superior to native protein, but below the isoelectric point, native protein showed better emulsifying activity. Drop in solubility below isoelectric point of the protein due to modification account for inferior emulsifying activity. Emulsion stability of the glycinin was significantly improved by acetylation. Repulsion between oil droplets due to greater net negative charges of the protein at the water oil interfaces due to acetylation reaction accounted for the improvement in emulsion stability. On Maillard reaction : Storge of the native protein with glucose induced browing, but in acetylated protein browning was inhibited due to the protein. Browing was found to lower emulsifying activity of the protein, and the decrease was greatest for the native protein and least for 90% acetylated protein. Gel Filtration Pattern of Purified Glycinin : HPLC patterns of purified gylcinin showed that retention times of main peaks between with mercaptoethanol and withot mercaptoethanol were almost the same as 6.16 and 6.19 min. However, those between with salt and without salt were little changed as 6.72 and 6.74 min. Change of the retention time by elution buffer containing NaCl suggested that conformation of glycinin was changed by NaCl. Having two hexagons jointed by electrostatic and hydrogen bonding forcesl, molecular weight of glycinin (11S) is 320,000. Change of the retention time by buffer containing NaCl means that this two hexagon of glycinin was splitted by unknown reasons. Enzyme Hydrolysis Pattern : Whole protein composed of glycinin, conglycinin, whey protein, 2S, and 5S was hydrolyzed by API or trypsin. The two peptides detected in the same retention time (16 and 20 min peaks) suggested that the peptides did not have arginine. The partially purified conglycinin (7S) was hydrolyzed by API or trypsin. The number of peptides fraction that could be isolated from digested conglycinin by API or trypsin were 10 and 10, respectively. Content of intact protein in 7S/trypsin is higher than that of 7S/API because enzyme activity of API is five times higher than that of trypsin. When protein in folded state was commonly hydrolyzed, substrate protein was reduced by dithiothreitol (DTT) or mercaptoehanol. The purified glycinin (11S) was hydrolyzed by API or trypsin. The number of peptide fraction that could be isolated from digested glycinin by API or trypsin were 18 and 20, respectively. N-terminal Sequence : N-terminal peptide sequence of each protein in SDS-PAGE spot (11S) was not good. The reason of unclear results was due to failure of single polypeptide purification. That means SDS-PAGE pure purified spot was a hexamer which was not totally same homohexamer. The MS data supported our conclusion. Protein Properties of Egg Yolk Protein : Using defatted egg yolk, the proximate composition was analyzed. It contains 62 % proteins and still has 15 % lipids. In usual, during phospholipid extraction like as lechitin, all of the fats are not extracted. The data of our research can be applied for investigating the nutraceutical peptides in soy protein and directly applied for the production of high value added peptides. Our results will be published in high qualified journal. Also our data must be used to purify the monomer polypeptide in glycinin hexamer or conglycinin.

목차 Contents

• 제 1 장 서론(Introduction)...15
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황(Comparison to Similar Works done in Korea and Abroad)...17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과(Content of the Work and the Results)...21
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도( Percentage of the Work done and the Importance)...70
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획(Application of the Work)...70
• 제 6 장 참고문헌(References)...71