초록 ▼

본 연구에서는 참치 정소로부터 핵산복합물질을 추출, 분리 및 정제하여 제품화 할 수 있는 기술을 개발하고, 추출된 핵산복합물질을 이용하여 면역능의 증가효과, 항피로효과, 학습능력 향상효과, 항산화효과 등에 대한 생리활성효과를 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 규명할 뿐만아니라 추출된 제품의 물리·화학적 성질을 파악하고 개선시켜 산업적으로 이용이 가능하도록 생산방법 및 조건을 확립함으로써 면역능을 향상시키고 항산화 및 항피로효과를 갖는 식품의 원료로서 이용하고, 일본에서 수입되고 있는 연어백자추출물의 대체물질로 이용하며

본 연구에서는 참치 정소로부터 핵산복합물질을 추출, 분리 및 정제하여 제품화 할 수 있는 기술을 개발하고, 추출된 핵산복합물질을 이용하여 면역능의 증가효과, 항피로효과, 학습능력 향상효과, 항산화효과 등에 대한 생리활성효과를 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 규명할 뿐만아니라 추출된 제품의 물리·화학적 성질을 파악하고 개선시켜 산업적으로 이용이 가능하도록 생산방법 및 조건을 확립함으로써 면역능을 향상시키고 항산화 및 항피로효과를 갖는 식품의 원료로서 이용하고, 일본에서 수입되고 있는 연어백자추출물의 대체물질로 이용하며 나아가 수출까지 가능하도록 개발하는 것을 목표로 하였다.
이와같은 목표를 달성하기 위해 주관연구기관에서는 국내에서 이용되고 있는 다획성 어류 중에서 대량 이용되고 부산물이 다량 발생하는 참치정소를 이용하여 핵산과 단백질이 결합된 핵산복합물질 및 핵산물질과 같은 핵산 관련 물질의 분리·정제밥법을 개발하고 핵산함량, 단백질함량, 회분함량, 무기질 조성 및 분자량 분포 등의 특성을 조사하여 추출물질의 성분을 파악하고 이를 통해 대량생산을 위한 Scale-up을 실시하여 산업적으로 생산이 가능하도록 하였으며, 참치정소 이외에 다획성 어종인 대구와 명태 등의 정소를 이용하여 핵산 관련 물질의 추출가능성을 타진하였다. 그리고, 주관연구기관에서는 수행하기 어려운 핵산복합물질의 생리활성 연구에 대해서는 서울대학교 약학대학과 협동 및 위탁연구를 병행하였는데, 협동연구에서는 추출된 핵산복합물질을 이용하여 면역기능 개선에 대한 연구를 실시 하였는 바 1차년도에서는 복강세포군 및 비장내의 면역기능 개선, 대식세포 활성화작용을 연구하였고, 2차년도에서는 B 임파구의 활성화, 핵산복합물질의 섭취가 박테리아 감염에 미치는 영향 및 핵산섭취가 수축된 흰쥐 소장 점막의 회복에 미치는 영향에 관한 연구를 진행하였고 3차년도에서는 양 적혈구에 대한 지연형 과민반응에 관한 연구를 수행하였다. 위탁연구에서는 항피로 및 기억학습능력 향상효과와 항산화효과에 대해 연구하였는 바 1차년도에서는 항피로 및 지구력 증가효과 및 기억학습능력 증가효과를 연구하였고, 2차년도에서는 항산화효과 연구로서 생체 내 산화적 손상 보호효과, hydroxyl radical 포착효과, superoxide anion 생성저해효과, 지질 과산화반응 저해효과, oxidative stress에 의한 세포사멸 보호효과 등을 연구하였고, 3차년도에서는 박테리아를 이용한 항돌연변이효과, 실험동물을 이용한 생체 내 산화적 손상 유도 및 보호효과와 더불어 세포배양을 이용한 산화적 세포사멸 및 분자생물학적 작용기전 규명에 관한 연구를 수행하였다.

Abstract ▼

A large amount of a nucleic acid-protein complex was extracted from tuna spermary. The extraction process and effects of this complex on cellular immune responses, anti-fatigue, learning ability and antioxidative activity were investigated in this study.t he nucleic acid-protein complex separated by

A large amount of a nucleic acid-protein complex was extracted from tuna spermary. The extraction process and effects of this complex on cellular immune responses, anti-fatigue, learning ability and antioxidative activity were investigated in this study.t he nucleic acid-protein complex separated by 10% NaCl solution was named DW-DNA, which was composed approximately of 56.5% nucleic acid and 2.8% yield and by ultra filtration was 82.4% nucleic acid and 2.0% yield. As for using modified acid hydrolysis method, the extract was composed of above 89% nucleic acid and 2.2% yield. When fed to ICR mice, DW-DNA increased the number of peritoneal exudate cells by two-folds compared with that in the controls. The ratio of polymorphonuclear leucocyte (PMN) cells infiltrated into the peritoneal cavity increased from 2% to 40% after oral administration ofDW-DNA. AS for nonspecific immune responses, the acid phosphatase production and superoxide anion secretion by activated macrophages increased by 1.6-fold and 1.3-fold, respectively, in the DW-DNA treated mice compared with the tumorcontrols. Administration of DW-DNA to the BALB/c mouse increased the first and second antigen specific IgM and IgG. The production of IgG2a and interferon gamma (IFN-r) in splenocytes culture supernatant was increased by such treatment which indicates Th1 response was enhanced by DW-DNA administration. The anti-fatigue effect of DW-DNA was determined by testing persistance in malnourished mice on a rota-rod and swimming time in weight-loaded rats. The persistance time on the rota-rod increased by 30.7%, 12.2%, and 53% in mice fed DW-DNA at the concentrations of 50, 100, 200mg/kg, respectively. The swimming time increased significantly (p<0.05) by 15.4%, 21.7% and 28.7%, respectively, in mice fed DW-DNA at the same concentrations. Effects of DW-DNA on antioxidative activity were investigated CCl4-induced lipid peroxidation in rat liver was supressed to maximum 50% and DW-DNA has hydroxyl radical and superoxide anion scavenging effect. In case ofmutagenesis of Salmonella Typhimurium TA102 induced by tert-butylhydroperoxide was suppresed to 24%, this shows DW-DNAhas anti-mutagenesis effect. The protective effects of the nucleic acid complex from tuna spermary on NO-inducedoxidative damage and cell death were investigated. Administration of the peroxynitrite donor 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) (45mg/kg i.p.)increased the levels of serum nitrate/nitrite and PGE2 (cyclooxygenase end-product), which was attenuated by DW-DNA. Inanother experiment, DW-DNA inhibited φX174 DNA strand scission induced by the NO donor sodium nitroprusside (SNP)These results indicated that the nucleic acid-protein complex can be mass-produced using ultra-filtration and may act as animmunomodulator, anti-fatigue and antioxidative agent.

목차 Contents

• 제 1 장. 서론...19
• 제 1 절. 연구개발의 필요성...19
• 1. 연구개발의 필요성...19
• 2. 국내ㆍ외 관련연구의 현황 및 문제점...20
• 제 2 절. 연구개발의 목표 및 연구범위...21
• 제 2 장. 연구 방법...23
• 제 1 절. 참치정소로부터 핵산물질 및 핵산복합물질의 추출...23
• 제 2 절. 핵산복합물질의 규격 및 특성에 관한 연구...24
• 1. 핵산 함량 분석...24
• 가. HPLC를 이용한 정량분석...24
• 나. Diphenyl amine 시약을 이용한 분석...25
• 다. STS(Schmidt-Thanhauser-Schneider) 분석...25
• 2. 분자량 분포 분석...25
• 3. 프로타민 함량 분석...26
• 제 3 절. 핵산복합물질의 면역활성 연구...26
• 1. 체액성 및 세포성 면역에 미치는 영향...26
• 가. 마우스의 복강세포군에 대한 작용...26
• 나. 비장세포내 면역세포에 대한 작용...27
• 다. 대식세포 활성화에 대한 작용...27
• 2. 세포부활 능력에 대한 연구...29
• 가. B 임파구 활성화...29
• 나. 핵산섭취가 박테리아 감염에 미치는 영향...29
• 다. 수축된 흰쥐 소장 점막의 회복에 미치는 영향...30
• 3. 양 적혈구에 대한 지연형 과민반응 연구...31
• 가. 양적혈구에 대한 지연형 과민반응의 유도 및 측정...31
• 나. 지연형 과민반응의 주요 세포 분석...32
• 다. 지연형 과민반응의 양상 분석...32
• 라. 지연형 과민반응의 병원균에의 적용...33
• 제 4 절. 항피로 및 학습능력 향상 효과에 대한 연구...34
• 1. 근육의 항피로 효과 연구...34
• 2. 중량부하 동물의 유영지속 실험...34
• 3. 격일 절식 동물의 지구력 실험...34
• 4. T-미로에서의 기억 능력 실험...35
• 제 5 절. 핵산복합물질의 항산화 효과에 대한 연구...35
• 1. 실험동물을 이용한 생체내 산화적 손상에 대한 보호효과...35
• 가. 사염화탄소 유도에 의한 산화적 손상 보호효과...35
• 나. NO donor에 의한 산화적 손상 유도...36
• 다. Nitrite assay...36
• 라. ALT assay...37
• 마. 조직내 GSH/GSSG level 측정...37
• 2. 지질의 과산화 반응에 대한 저해 효과...37
• 3. Hydroxyl raidcal에 대한 포착 효과...38
• 가. Deoxyribose assay...38
• 나. Trapping assay...38
• 다. Hydroxyl radical로 유도한 DNA 손상과 이에 대한 보호효과...38
• 4. NO donor로 유도한 DNA 손상 억제 효과...39
• 5. Superoxide anion에 대한 포착효과...39
• 6. Bacteria를 이용한 항돌연변이 효과...39
• 7. 분화된 HL-60 세포에서의 Superoxide anion 생성 저해 효과...40
• 8. Oxidative stress에 의한 세포사멸 유도 및 보호효과...40
• 9. 염증반응 억제 효과...40
• 10. 세포 배양을 이용한 산화적 세포사멸 보호효과 및 분자 생물학적 작용기전 규명...41
• 가. 세포 독성에 대한 보호효과...41
• 나. apptosis 유도에 대한 억제 효과...42
• 다. PARP / Caspase-3 억제 효과 검토...42
• 제 3 장. 연구결과...45
• 제 1 절. 핵산물질과 핵산복합물질의 추출방법 및 특성에 관한 연구...45
• 1. 참치정소로부터 핵산물질 및 핵산복합물질의 최적 추출방법 연구...45
• 가. salt의 첨가농도를 달리한 열수추출법에 의한 핵산복합물질의 추출...45
• 나. 산 가수분해법에 의한 핵산복합물질의 추출...47
• 다. Alkali Lysis에 의한 핵산복합물질의 추출...49
• 라. UF(Ultra Filtration)를 이용한 핵산복합물질의 추출...50
• 마. 산 가수분해법의 변형에 의한 핵산물질의 추출...52
• 2. 각 추출방법별 핵산복합물질의 분자량 분포 분석...55
• 3. 핵산복합물질의 대량생산을 위한 Scale-up 연구...59
• 가. 보유 공장설비를 이용한 핵산복합물질의 추출...59
• 나. UF(Ultra Filtration) 임차를 통한 Scale-up...60
• 제 2 절. 핵산복합물질의 면역활성 연구...62
• 1. 체액성 및 세포성 면역에 미치는 영향...62
• 가. 마우스의 복강내 세포에 대한 작용...62
• 나. 마우스의 비장내 면역세포에 대한 작용...62
• 다. 마우스의 대식세포 활성화에 대한 작용...65
• 2. 세포부활 능력에 대한 연구...68
• 가. B 임파구 활성화...68
• 나. 수축된 흰쥐 소장 점막의 회복에 미치는 영향...73
• 다. 핵산섭취가 박테리아 감염에 미치는 영향...79
• 3. 양 적혈구에 대한 지연형 과민반응 연구...86
• 가. 양적혈구에 대한 지연형 과민반응의 유도 및 측정...86
• 나. 지연형 과민반응의 양상분석...88
• 다. 지연형 과민반응의 주요 세포 분석...94
• 라. 지연형 과민반응의 병원균에의 적용...94
• 제 3 절. 항피로 및 학습능력 향상 효과에 대한 연구...103
• 1. 근육의 항피로 효과 연구...103
• 2. 중량부하 동물의 유영지속 실험...103
• 3. 격일 절식 동물의 지구력 실험...104
• 4. T-미로에서의 기억 능력 실험...104
• 제 4 절. 핵산복합물질의 항산화 효과에 대한 연구...108
• 1. 실험동물을 이용한 생체내 산화적 손상에 대한 보호효과...108
• 가. 사염화탄소 유도에 의한 산화적 손상 보호효과...108
• 나. NO donor에 의한 산화적 손상 유도...108
• 다. Nitrite assay...111
• 라. ALT assay...111
• 마. 조직내 GSH/GSSG level 측정...114
• 2. 지질의 과산화 반응에 대한 저해 효과...114
• 3. Hydroxyl radical에 대한 포착 효과...119
• 가. Deoxyribose assay...119
• 나. Trapping assay...119
• 다. Hydroxyl radical로 유도한 DNA 손상과 이에 대한 보호효과...119
• 4. NO donor로 유도한 DNA 손상 억제 효과...122
• 5. Superoxide anion에 대한 포착효과...126
• 6. Bacteria를 이용한 항돌연변이 효과...126
• 7. 분화된 HL-60 세포에서의 Superoxide anion 생성 저해 효과...129
• 8. Oxidative stress에 의한 세포사멸 유도 및 보호효과...129
• 9. 염증반응 억제 효과...134
• 10. 세포 배양을 이용한 산화적 세포사멸 보호효과 및 분자생물학적 작용기전 규명...134
• 가. 세포 독성에 대한 보호효과...134
• 나. apptosis 유도에 대한 억제 효과...137
• 다. PARP / Caspase-3 억제 효과 검토...137
• 제 4 장. 고찰...141
• 참고문헌...143