초록 ▼

연구목표:
서울대학병원 당뇨병 클리닉을 방문한 인슐린 비의존성 당뇨병환자를 소변 알부민뇨에 따라 정상 알부민뇨 환자군 30명(하루 알부민 배설량이 30mg 미만), 미세 알부민뇨 환자군 30명(하루 요중 알부민 배설량이 30-300mg)과 거대 알부민뇨 환자군 20명(하루 요중 알부민 배설량이 300-1500mg)의 세 군으로 나누었다. 이들 환자들의 혈액과 소변검사, 합병증검사, 혈장 지단백 분리 및 측정, PAI-1 활성도, PAI-1 4G/5G 유전자다형성을 분석하였다.
당화 단백질(AGE-BSA)이 배양

연구목표:
서울대학병원 당뇨병 클리닉을 방문한 인슐린 비의존성 당뇨병환자를 소변 알부민뇨에 따라 정상 알부민뇨 환자군 30명(하루 알부민 배설량이 30mg 미만), 미세 알부민뇨 환자군 30명(하루 요중 알부민 배설량이 30-300mg)과 거대 알부민뇨 환자군 20명(하루 요중 알부민 배설량이 300-1500mg)의 세 군으로 나누었다. 이들 환자들의 혈액과 소변검사, 합병증검사, 혈장 지단백 분리 및 측정, PAI-1 활성도, PAI-1 4G/5G 유전자다형성을 분석하였다.
당화 단백질(AGE-BSA)이 배양된 메산지움의 기질 형성에 관여하는 신호 전달 체계의 영향을 조사하기 위하여, 세포 분열이 정지된 배양된 사람 메산지움 세포에 당화 단백질을 일정시간 반응시킨 후 콜라젠 mRNA 발현량 및 사람 신호 전달 체계 및 PKC 활성도의 변화를 조사한다. 5계대에서 7계대 배양된 사람 메산지움 세포의 성장을 48시간 정지시킨 후, 각각 200㎍/ml의 BSA, AGE-BSA, BSA-AM을 일정 시간 반응시킨 후, PKC 의 활성도를 조사하고, α1(I) collagen, α1(IV) collagen 발현을 Northern blot analysis를 이용하여 분석한다. 6-well plate에서 반응된 실험군의 세포 추출물은 방사성 동위 원소에 의한 PKC 활성도를 조사하는 검사에 사용한다. 100 mm petri-dish에서 배양된 실험군의 세포층으로부터 세포질과 세포막 분획을 초고속 원심분리기를 이용하여 얻은 후 PKC 여러 아형의 발현 여부를 측정하기 위하여 immunoblot를 시행한다. 또한 GFX나 PMA를 각각의 BSA, AGE-BSA, BSA-AM를 처리하기 전에 미리 가하고 콜라젠 mRNA 발현을 조사하므로써 콜라젠 유전자에 대한 당화 단백질의 조절 작용에 PKC가 어떻게 관여하는지를 조사한다. 마지막으로 콜라젠 발현에 있어 PKC와 TGF-β 의 연관성을 조사한다.

연구방법:
1. 혈액 및 소변 검사:
1) 혈장의 지단백 및 지방은 Hitachi 747 자동분석기로, 요 알부민은 nephelometry으로 BN-100을 이용하여 측정.
2) tPA 및 PAI-1의 측정: ELISA와 substrate DESAFIB-X??을 이용하여 활성도 측정
3) PAI-1 4G/5G 유전자 다형성 측정
2. 배양된 사람 메산지움 세포에 각각 BSA, AGE-BSA, BSA-AM을 가하고 15분부터 48시간 동안 여러 시간대에서 반응
시킨 후 세포 추출물에서 PKC 활성도를 측정
3. 배양된 사람 메산지움 세포에 BSA, AGE-BSA, BSA-AM을 가하고 15분부터 48시간 동안 여러 시간대에서 반응시킨
후 세포 추출물을 세포막과 세포질로 분리한 후 각 분획에 대해 PKC 아형에 대한 immunobloting (Western
blotting)을 시행
4. 각 실험군의 세포층에서 총 RNA를 분리한 후 α1(I) collagen, α1(IV) collagen, β-action cDNA probes를 이용하
여 Northern blotting을 시행. 또는 미리 GFX 또는 PMA와 반응시킨 후 AGEs를 넣고 반응시킨 후 각 콜라젠 mRNA
의 발현을 조사
5. 콜라젠 mRNA 발현에 있어 PKC와 TGF-β에 연관성이 있는지를 Northern blot을 이용하여 조사

Abstract ▼

Goal of the research
Non-Insulin dependent diabetes mellitus patients with albuminuria to invite Seoul National Univ. Hospital clasified 3-group; normal albuminuria (30mg/day↓, 30-person), micro-albuminuria(30-300mg/day, 30-person) and macro-albuminuria(300-1500mg/day, 20-person). We analyzed b

Goal of the research
Non-Insulin dependent diabetes mellitus patients with albuminuria to invite Seoul National Univ. Hospital clasified 3-group; normal albuminuria (30mg/day↓, 30-person), micro-albuminuria(30-300mg/day, 30-person) and macro-albuminuria(300-1500mg/day, 20-person). We analyzed blood, urine, complications, PAI-1 activity, PAI-1 4G/5G gene polymorphism.
Also we investigated whether AGE-BSA affects to the signal transduction and extracellular matrix production. After reaction with 200㎍/ml BSA, AGE-BSA, and AGE-AM on mesangial cells, respectively, we investigate PKC activity, α1(I) and α1(IV) collagen mRNA expression through Northern blot analysis. Also, after reaction with AGE-BSA, mesangial cells are divided to cytosol and membrane fraction and then carry out immunoblot about PKC subtypes. Through GFX or PMA treatment to mesangial cells with AGE-BSA we analyze whether associate between PKC and collagen gene expression. Finally we analyze association with PKC and TGF-β in the collagen gene expression.

Method
1. Blood and Urine
1) lipoprotein and lipid --- by Hitachi 747 automatic analyzerUrine albumin --- by nephelometry
2) tPA and PAI-1: ELISA and activity through substrate DESAFIB-X
3) PAI-1 4G/5G gene polymophism
2. PKC activity: cultured human mesnagial cells with BSA, AGE-BSA, AGE-AM(15min∼48h)
3. Immunoblot: from membrane and cytosol fraction on cultured mesangial cells with BSA, AGE-BSA, AGE-AM
(PKC subtype)
4. Northern blot: total RNA isolation →α1(I), α1(IV) collagen mRNA expression through PKC inhibitor(GFX)
→ collagen mRNA expression association between TGF-β expression and PKC

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...14
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결과...16
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...19
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...21
• 제1세부연구개발과제 연구결과(세부과제별로 작성)...23
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...24
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...24
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...27
• 4,제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...28
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...30
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획...31
• 7.참고문헌...31
• 8.첨부서류...33
• 제2세부연구개발과제 연구결과(세부과제별로 작성)...42
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...43
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...44
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...45
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...46
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...49
• 6.제2세부연구개발과제의 활용계획...51
• 7.참고문헌...51
• 8.첨부서류...58