보고서 정보
주관연구기관 |
충남대학교 Chungnam National University |
연구책임자 |
박승길
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2004-06 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001651 |
과제고유번호 |
1460003704 |
사업명 |
보건산업진흥(보건의료기술인프라개발) |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
PLD.혈관평활근 세포.증식.placenta protein 6.RET/PTC3.PLD.proliferation.vascular smooth muscle cell.placental protein 6.RET/PTC3.
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초록
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* 연구개발사업의 목적 : 혈관평활근 세포(vascular smooth muscle cell : VSMC)의 증식은 동맥경화증 (atherosclerosis), 재발협착증 (retenosis) 등의 현상에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 한편 PLD 활성이 세포증식에 관여함이 밝혀졌고, VSMC의 증식에 관여하는 인자들은 PLD를 활성화시킨다고 알려져 있다. 따라서 VSMC 증식인자에 의한 VSMC의 증식과 PLD와의 상관관계를 밝히고, 그것을 제어할 수 있는 방법을 찾아내어 관련 질환의 예방 및 치료에 기여한다.
* 연구
* 연구개발사업의 목적 : 혈관평활근 세포(vascular smooth muscle cell : VSMC)의 증식은 동맥경화증 (atherosclerosis), 재발협착증 (retenosis) 등의 현상에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 한편 PLD 활성이 세포증식에 관여함이 밝혀졌고, VSMC의 증식에 관여하는 인자들은 PLD를 활성화시킨다고 알려져 있다. 따라서 VSMC 증식인자에 의한 VSMC의 증식과 PLD와의 상관관계를 밝히고, 그것을 제어할 수 있는 방법을 찾아내어 관련 질환의 예방 및 치료에 기여한다.
* 연구방법 : PLD assay, MTT assay, immunoblotting analysis, immunoprecipitation analysis, transwell migration assay, bacteria two-hybrid, confocal microscopy 등을 사용하였다.
* 연구결과 : 먼저 VSMC 증식인자로 알려진 PDGF, angiotensin II, LDL은 PLD 효소활성과 세포증식을 모두 증가시켰고, LPA, homocystein은 PLD 효소활성은 증가시켰지만 세포증식과 migration을 모두 억제시켰다. 그리고 LPA에 의한 PLD 효소 활성 증가는 Erk 1/2 pathway 억제제인 PD98059와 protein tyrosine kinase 억제제인 genistein, 그리고 EGFR 억제제인 AG1478에 의해 억제되었다. 그리고 H2O2 에 의해서도 PLD 효소활성이 증가하고, LPA에 의한 PLD 활성을 항산화제인 NAC이 억제시키지 못했다. 이는 VSMC 증식 인자에 의한 PLD 활성과 세포증식은 활성산소종을 경유한다는 것을 말해준다. 또한 LPA에 의해서 VSMC의 migration이 감소한다. 세포 증식과 PLD와의 상관관계를 분자수준에서 확인하기 위하여 bacteria two-hybrid를 실시하여 PLD2와 interaction하는 단백질인 placental protein 6(PL6)를 찾아냈다. 토끼에서 PL6에 대한 항체를 제조하여 PL6의 위치를 확인한 결과 골지체에 존재하며, PLD2와 colocalized 되어있는 것을 확인하였고, co-immunoprecipitation을 통하여 확인하였다. PL6는 PLD2와 함께 과발현 시키면 PLD 효소활성을 억제시키고, 단독으로 과발현 시키면 세포의 증식을 증가시킨다. 그리고 그 증가를 PLD2가 억제시키며, 두 단백질을 함께 과발현 시키면 세포의 migration이 감소한다. 다음으로 oncogenic factor로 알려진 non-receptor tyrosine kinase인 c-Src, RET/PTC3와 PLD와의 상관관계를 알아봤다. RET/PTC3와 PLD2, PLD1은 co-immunoprecipitation을 통하여 서로 결합하는 단백질이라는 것을 확인하였다. 하지만 RET/PTC3에 의한 PLD2 효소활성은 변화가 없었다. 반면에 PLD2 과발현에 의해서 RET/PTC3의 단백질 양이 급격히 감소하고, RET/PTC3의 substrate로 알려진 stat3의 활성이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 하지만 Src의 경우는 PLD2 과발현에 의해 단백질 양의 감소가 나타나지 않았다. Stat1의 경우 luciferase 활성을 측정해본 결과 RET/PTC3에 의해 증가하는 stat1의 활성 증가가 PLD2 과발현에 의해 거의 사라지고, PLD2-Si-RNA에 의해서는 증가하는 결과를 얻었고, Src의 경우는 PLD2 과발현에 의해 오히려 stat1 활성이 더욱 증가했다. VSMC에 v-Src, hPLD2, hPLD2-Si-RNA를 transfection하여 stat1 luciferase 활성을 측정해본 결과 역시 Src와 PLD2가 함께 과발현되면 stat1 활성이 증가하고, hPLD2-Si-RNA에 의해 그 활성이 억제되었다. 이는 세포증식에 중요한 인자로 알려진 RET/PTC3와 c-Src에 대해서 PLD2가 서로다른 조절 기전을 가지고 있으며, 세포증식에서 PLD2가 RET/PTC3 신호는 억제하고, c-Src 신호는 증가시켜준다는 것을 알 수 있다.
본 연구를 통하여 VSMC 증식인자들 중에서 angiotensin II, LDL, 그리고 PDGF에 의해서는 세포증식과 PLD 효소활성이 함께 증가하고, LPA와 homocystein에 의해서는 세포증식이 억제되고 PLD 효소활성이 증가하는 결과를 얻었으며, LPA에 의한 PLD 효소활성 증가는 Erk 1/2, EGFR, 그리고 trotein tyrosine kinase를 경유하고, 그 효소활성 증가는 세포증식과 migration을 감소시킨다는 것을 알았다. 그리고 PL6에 의한 세포증식을 PLD2가 억제하였고 PL6와 PLD2가 함께 과발현되면 cell migration이 감소하는 것을 알았다. 또한 세포증식에 중요한 인자로 알려진 RET/PTC3를 PLD2가 억제하는 역할을 하는 반면에 c-Src의 경우는 PLD2가 c-Src에 의한 세포증식 신호를 더욱 증폭시켜준다는 것을 알았다.
Abstract
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The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is critically involved in the atherosclerosis and restenosis. Phospholipase D (PLD) is activated by VSMC proliferation factors and activated PLD is involved in growth of VSMCs. Although many VSMC proliferation factors have been reported as an
The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is critically involved in the atherosclerosis and restenosis. Phospholipase D (PLD) is activated by VSMC proliferation factors and activated PLD is involved in growth of VSMCs. Although many VSMC proliferation factors have been reported as an activator of PLD, the critical mechanism remain unknown. Therfore, it is crucial to understand how activated PLD by VSMC proliferation factors.
In the present study, we investigated the relation between VSMC proliferation factors and PLD activation. PLD activity and cell proliferation were increased by PDGF, LDL, angiotensin II, and H2O2 in hVSMCs, but homocysteine and LPA increased only PLD activity. Cell proliferation was inhibited by homocysteine and LPA in hVSMCs. LPA-induced PLD activation is mediated by Erk 1/2 pathway, EGFR, and protein tyrosine kinase, but not reactive oxygen species (ROS).
PLD activity was increased, but cell proliferation and migration were inhibited by LPA.
Placental protein 6 (PL6) interacts with hPLD2 in golgi apparatus. Overexpression of PL6 increased the proliferation of cells. Interestingly, hPLD2 blocked proliferation of cell by overexpression of PL6. Co-overexpression of PL6 and PLD2 blocked PLD activity and cell migration.
We demonstrate for the first time that PLD1 and PLD2 interact with constitutively activated protein tyrosine kianse, RET/PTC3 (rearranged in transformation/papillary thyroid carcinomas 3). RET/PTC gene rearrangements are the most frequent genetic alterations identified in papillary thyroid carcinoma. Overexpression of hPLD2 blocked activation of stat1 and stat3 by RET/PTC3.
In addition, the level of protein of RET/PTC3 was decreased, but stat activation by v-Src was increased by overexpression of hPLD2. In conclusion, VSMC proliferation factor, PDGF, LDL, angiotensin II and H2O2 increase both cell proliferation and PLD activation, but LPA and homocysteine increase only PLD activation. Activation of PLD by LPA is mediated by Erk 1/2, EGFR, and protein tyrosine kinase pathway but not ROS. We demonstrate for the first time that PLD2 interact with PL6 in golgi apparatus. PL6 increase the proliferation of cells, and PL6-induced the cell proliferation is inhibited by hPLD2 overexpression. In addition, PLD1 and PLD2 interact with RET/PTC3. hPLD2 inhibit activation of stat1 and stat3 by RET/PTC3 and decrease the level of protein of RET/PTC3.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 4
- 목 차 ... 5
- Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 6
- (한글) ... 6
- (영문) ... 7
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 8
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 30
- 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함) ... 32
- 4.1. 사업화 목표 달성도 ... 32
- 4.2. 사업화 수준(계획 및 완료 포함) ... 32
- 4.3. 사업화 우수성 ... 32
- 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 33
- 5.1 총괄연구개발과제의 연구결과 ... 33
- 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 48
- 6.1 기술적 파급효과 ... 48
- 6.2 경제적 파급효과 ... 48
- 6.3 사회적 파급효과 ... 48
- 7. 첨부서류 ... 48
- 참고문헌 ... 49
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