초록 ▼

신종 한타바이러스의 숙주동물은 대륙밭쥐로 북유럽지역의 신증후출혈열을 일으키는 푸말라바이러스 숙주동물인 bank vole과 같은 밭쥐아과에 속한다. 최근 러시아 극동지역과 일본 훗카이도에 서식하는 밭쥐아과에 속하는 설치류에서 하바로브스크바이러스와 푸말라바이러스들에 대한 보고들이 있었으며 이 바이러스들을 분리하고 그특성을 규명하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구는 국내에 서식하고 있는 각종 야생들쥐인 한타바이러스 감염실태 대륙밭쥐로부터 신종 한타바이러스의 분리, 숙주동물의 생태학적 조사, 호발지역규명, 질병양상 분석, 유

신종 한타바이러스의 숙주동물은 대륙밭쥐로 북유럽지역의 신증후출혈열을 일으키는 푸말라바이러스 숙주동물인 bank vole과 같은 밭쥐아과에 속한다. 최근 러시아 극동지역과 일본 훗카이도에 서식하는 밭쥐아과에 속하는 설치류에서 하바로브스크바이러스와 푸말라바이러스들에 대한 보고들이 있었으며 이 바이러스들을 분리하고 그특성을 규명하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구는 국내에 서식하고 있는 각종 야생들쥐인 한타바이러스 감염실태 대륙밭쥐로부터 신종 한타바이러스의 분리, 숙주동물의 생태학적 조사, 호발지역규명, 질병양상 분석, 유전학적 특성 규명, 감별진단 항원개발 및 병인성, 세포사멸 조절기작 규명와 관한 연구를 연차적으로 수행함으로써 국내 새로운 신증후출혈열 환자의 임상적 특성을 규명하고 감별진단항원 개발에 의한 조기진단과 예방대책을 수립하고자 하였다.
채집한 들쥐 9종 1,437마리를 대상으로 한타바이러스의 감염율을 조사한 결과 등줄쥐의 감염율은 12.9% 흰넓작다리붉은쥐는 14.1% 대륙밭쥐는 12.8%로 나타났다. 신종 한타바이러스의 숙주동물인 대륙밭쥐의 지역별 감염율을 보면 강원도가 12.8%이었으며 전북 무주군에서 채집된 대류밭쥐의 항체양성율은 21.2%로 매우 높게 나타났다. 2마리의 대륙밭쥐 폐조직액을 접종하고 5대 계대배양 세포로부터 각각 한타바이러스 분리하엿으며 무주에서 채집한 대륙밭쥐에서 신종 한타바이러스의 존재를 확인하였기 때문에 무주바이러스(Muju virus)라고 명명하였다. 신종 한타바이러스인 무주바이러스의 중화항체가는 무주바이러스와 푸말라바이러스에 대해 1,280을 보임으로써 무주바이러스는 북유럽에서 분리된 푸말라바이러스와 유사한 국내의 새로운 혈청형임을 증명하였다. 항체양성인 대륙밭쥐인 폐조직용액 용액을 숙주동물인 항체 음성의 대륙밭쥐와 햄스터에 접종하고 일정기간별로 항체형성을 증명하였으나 폐조직내의 바이러스 증식은 확인할 수 없었다.
한타바이러스 항체 양성인 대륙밭쥐로부터 신종 한타바이러스 유전자와 다양성에 대하여 연구한 결과 한타바이러스 항체 양성인 쥐 30수의 폐조직에서 역전사-중합효소연쇄반응법에 의한 무주바이러스 항원검출율은 30%(9/30)이었다. 중합요소연쇄반응법으로 대륙밭쥐 9수의 간조직으로부터 마이토콘드리아 DNA cytochrome b 유전자의 424-bp 길이 염기서열 분석 결과 국내대륙밭쥐의 변이율은 0-1.6%이었다. 무주바이러스의 전체 S 유전자 길이는 1857-bps 이었으며 42-bps길이의 5′NCR과 513-bps 길이의 3′NCR을 포함하였다. 무주바이러스의 S 분절 염기서열 분석 결과 기존에 알려진 한타바이러스 중 가장 유사한 푸말라바이러스 Sotkamo 주와는 23.1% 의 차이를 부였고 아미노산 서열에서는 5.8% 차이가 났다. M 분절 241-bps 염기서열 분석 결과 국내 무주바이러스의 다양성은 2.5-17.4% G2단백 80개 아미노산서열은 0-8.8%의 변이율을 나타내었다. S와 M 분절의 염기서열 및 아미노산서열의 계통수상에서 무주바이러스주들은 무주 그룹과 강원도 그룹의 2개의 아그룹으로 나누어졌고 두 그룹간의 유전자 재편성에 의한 분절간 이동현상은 발견되지 않았다.
1994년 1월에서 2000년 12월까지 7년간 열성질환 환자 중 신증후출혈열, 리케치아증 및 렙토스피라증 등이 의심되어 항체검사를 위해 의뢰된 혈액 약 17,556건을 대상으로 역학조사를 실시하였다. 한타바이러스에 대한 항체보유 검사 결과 평균 11.5%(2,022/17,556)의 항체양상율 이 조사되었다. 신증후출혈열은 남자가 여자보다 1.85배 높은 양성율을 나타내었으며 월별 분포에서 대부분의 양성자가 특히 10월에서 12월에 70%가 집중되어 있었다. 연령별 분포에서는 30대에서 50대가 가장 많았으며 간접형광항체 양상을 보인 혈청 중 81.8%가 IgM 항체양성으로 판명된다. 신종 한타바이러스에 대한 역학조사에서는 IgM-ELISA 검사결과에서 6.0%(1994년 10건, 1995년 13건, 1996년 20건, 1997년 20건, 1998년 30건, 1999년 14건, 2000년 7건)는 특이하게 무주바이러스에 대한 항체가가 한탄바이러스나 서울바이러스에 대한 항체가 보다 4배 이상 높게 관찰 되었다. 연령별 분포에서는 기존에 알려진 신증후출혈열 환자 분포와 유사하게 모든 연령층에서 항체양성례가 분포하고 있었으며 40대가 가장 많았다. 무주바이러스 감염의 월별 분포에서 대부분의 양성자는 한탄 및 서울바이러스 감염과 동일하게 10월에서 12월에 집중되어 있었다. 무주바이러스 감염에서도 한탄 및 서울바이러스 감염과 동일하게 남자가 여자보다 높은 양성율(64:36)을 나타내었다. 감별 진단항원 개발을 위해 한탄바이러스, 서울바이러스, 툴라바이러스 및 무주바이러스의 S 분절을 TA cloning vector에 cloning 하고 발현 벡터 pGEX-5X-3에 한타바이러스 S segment clone을 삽입하여 E. coli DH 5 α에서 발현시켰다. 발현된 한타비어러스 S segment GST fusion protein을 SDS-PAGE상에서 확인하였다. 75kDa 크기의 예상되는 band를 한탄바이러스, 서울바이러스, 툴라바이러스 및 무주바이러스 모두에서 확인할 수 있었다. 환자 혈청을 이용한 Western blot 검사에서 한탄바이러스와 서울바이러스, 그리고 툴라바이러스와 무주 바이러스는 서로 높은 교차반응을 나타내었다.
Apoptosis 과정에서 나타나는 chromosomal DNA fragmentation 은 두가지 방법으로 확인하였는데 먼저 감염된 세포에서 chromosomal DNA를 추출하여 일반적인 전기영동법으로 DNA laddering 여부를 관찰하였고 좀더 정확한 방법으로 세포 자체에서 잘라진 DNA말단을 형광물질로 labelling하는 in situ DNA-labelling (TUNEL)을 실시하였다. 한탄바이러스가 감염된 Vero E6 세포에서 전형적인 apoptosis 과정에서 관찰 할 수 있는 세포핵 붕괴 현상을 관찰할 수 있었다. Apoptosis 관련 단백질 Bcl-2와 Bax의 발현양을 각각의 단백질에 대한 antibody를 사용한 immunoblot으로 알아본 결과 Bax 단백질의 양적인 변화는 없었고 Bcl-2가 특이적으로 감소함을 관찰하였다. Caki 세포주에서는 Vero E6와 유사한 바이러스의 복제와 함께 세포의 apoptosis를 관찰할 수 있었으나 Hel299 세포주에서는 바이러스 복제는 Vero E6에 비해 현저히 낮았고 세포의 apoptosis도 관찰 할 수가 없었다. B치-2를 과량 발현하는 세포주를 제조하고 그세포주에 한탄바이러스를 감염시켰을 때 apoptosis가 억제되는지를 관찰 한 결과 Bcl-2 감소가 유전자 발현과정에서 down regulation 되기보다는 단백질 수준에서 분해가 촉진된다는 것을 암시하였다. 한탄바이러스를 감염시킨 생후 24-48시간된 suckling mouse 조직에서 훨씬 더 많은 세포들이 apoptosis로 사멸됨을 관찰하였다. 이러한 사실은 한탄바이러스 감염의 병리학적인 현상이 혈관 내세포의 투과성 증가와 더불어 apoptosis 과정이 함께 진행됨을 시사하고 있다.

Abstract ▼

Since we have reported the isolation of two distinct hantairuses from striped field mouse. A agrarius and urban rats R. norvegicus in Korea the world wide research on hantavirus have been extensively carried out. And several new hantaviruses hve continuously been identified in rodents worldwide. Rec

Since we have reported the isolation of two distinct hantairuses from striped field mouse. A agrarius and urban rats R. norvegicus in Korea the world wide research on hantavirus have been extensively carried out. And several new hantaviruses hve continuously been identified in rodents worldwide. Recently Khavarovsk virus and Vladivostok virus were identified in reed vole M. fortis in Far East Russia and Hokkaido Japan. The aim of the present study was to conduct the serological survey to find out the extent of prevalence for hantavirus in fection among indigenous wild rodents in Korea and to identify new hantavirus from E. regulus. Furthermore genetic characterization of new hantaviruses and mechanism of apoptosis and pathogenicity by hantavirus will be studied. These studies will provide effective prevention diagnostic antigen development and further research on hantaviral diseases.
Among trapped 1,437 indigenous wild rodents representing 9 species A agraius 12.9% A peninsulae 14.1% and E. regulus 12.8% were seropositive against hantavirus. The hantavirus infection of E. regulus the host rodent for new hantavirus occurred in Kangwon and Chunbuk province for 12.6% and 21.2% respectively. In addition we were successful to isolate virus from the lung tissues of E. regulus captured in Muju county Chunbuk province which was designated as Muju virus. Plaque reduction neutralization titer of E. regulus harbouring Muju virus was 1:1380 against Puumala virus which is isolated from bank vole in Scandinavia Western Europe the Balkans and Western Russia, This finding indicates that Muju virus is antigenetically closely related to Puumala virus. Adaptation of Muju virus was attempted in seronegative E. regulus or hamster in the laboratory. We have raised the antibody but virus propagation in lung tissue or adaptation in animal could not be identified.
1857-bp of nucleotide sequence containing 42-bp of 5‘ noncoding region and 513-bp of 3’noncoding region of the S segment of Muju viurs contained was amplified by reverse transcriptase-PCR(RT-PCR) from nin(30%) of 30 E. regulus. These sequences of S segment showed 2.4∼21.6% variation and 19.7∼26.4% variation from Sotkamo strain and 0∼5.8% variation in the amino acid sequences. In 241bp of M segment 2.5∼17.4% and variation in the amino acid sequences. In 241bp of M segment 2.5∼17.4% and 0∼8.8% variation in nucleotide and amino acid sequences were shown respectively. The nucleotide sequences variation of the 424bp fragment of mitochondrial DNA cytochrome b amplified by PCR were shown 0-1.6% The phylogenetic tree based on the S and M sequences both formed two subgroups Muju and Kangwon group and No segment shift was found by genetic reassortment between two gropus.
During June of 1994 and December of 2000, blood samples from 17.556 patients with fever were examined for hantaviral antibody by IFA test. Among them 11.5%(2,022/17,556) were found seropositive against hantavirus of which 81.8% was identified IgM positive by ELISA test. Positivly reacting sera were detected 1.85-fold higher in male than female. As monthly and aging differences seventy % of seropositive patients was intesively marked between October and December and at age of 30 to 50 years old. IgM-ELISA test for new hantavirus was detected 6.0% (10 in 1994; 13 in 1995; 20 in 1996; 20 in 1997; 30 in 1998; 14 in 1999;7 cases in 2000) seropositive and the antibody titer against Muju virus was shown 4-fold higher than against Hantaan or Seoul viruses.ㅁㄴ resulted in Hantaan and Seoul virus infections seroprevalence of Muju virus showed in similar pattern. at age sex(64;34 ratio in male and female) and nonthly difference. For development of efficient diagnostic antigen S segments of Hantaan Seoul Tula and Muju viruses was cloned into TA cloning vector then subcloned into the expression vector pGEX-5X-3 and expressed in E. coli DH5a. Each GST fusion proteins of 75kDa was confirmed on SDS-PAGE and immunoblot analysis.
Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis was confirmed by both DNA laddering of chromosomal DNA from infected cells and in situ DNA-labelling (TUNEL) Vero E6 cells infected by the Hantaan virus exhibited characteristic feature of apoptosis, disruptionof nuclei. In analysis of Bcl-2 and bax proteins by immunoblot the level of Bax protein was not changed but Bcl-2 was significantly reduced. Viral replication required for induction of apoptosis was observed in Caki cell as in Vero E6 cell. The finding of the reduced level of Bcl-2 protein in the HTN-infected cells which is overexpressed Bcl-2 protein suggests a possibility for the proteolytic cleavage rather than downregulation. Much more apoptotic cell death was observed in various organ of Hantaan virus infected suckling mouse (less than 48hr after born). These finding implicate that hantavirus pathogenicity correlates with cellular permissiveness as well as apoptosis in endothelial cell.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...13
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...19
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...21
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...26
• 6.첨부서류...28
• 제1세부연구개발과제 연구결과...59
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...61
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...62
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...65
• 4.제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...82
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...84
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획...85
• 7.참고문헌...86
• 제2세부연구개발과제 연구결과...89
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...91
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...92
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...95
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...103
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...106
• 6.제2세부연구개발과제의 활용계획...107
• 7.참고문헌...108
• 제3세부연구개발과제 연구결과...111
• 1.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...113
• 2.제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...116
• 3.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...119
• 4.제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...201
• 5.제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...202
• 6.제3세부연구개발과제의 활용계획...203
• 7.참고문헌...204
• 제4세부연구개발과제 연구결과...207
• 1.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...209
• 2.제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...211
• 3.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...213
• 4.제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...224
• 5.제4세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...225
• 6,제4세부연구개발과제의 활용계획...226
• 7.참고문헌...227