초록 ▼

본 연구 사업단에서는 골관절 질환 치료를 위한 약침용 소염 진통제 개발을 위해 총 3년간에 걸쳐 약침제제로 응용이 가능한 봉독 및 방풍 분획물을 이용하여 분획물중 유효성분을 검증하고, in vivo 및 in vitro 실험을 통한 안전성 검증 및 일반 약리실험을 수행한 결과 아래와 같은 결과를 얻었기에 보고함.
제 1 세부 과제
1. 봉독과 방풍 추출물을 이용한 관절염 치료를 위한 약침용 제제 개발을 위한 소염효능 검증 실험결과, 봉독 추출물중 수용성 추출물에서 방풍은 에틸아세테이트 추출물에서 발목 부종, 신생 골증식,

본 연구 사업단에서는 골관절 질환 치료를 위한 약침용 소염 진통제 개발을 위해 총 3년간에 걸쳐 약침제제로 응용이 가능한 봉독 및 방풍 분획물을 이용하여 분획물중 유효성분을 검증하고, in vivo 및 in vitro 실험을 통한 안전성 검증 및 일반 약리실험을 수행한 결과 아래와 같은 결과를 얻었기에 보고함.
제 1 세부 과제
1. 봉독과 방풍 추출물을 이용한 관절염 치료를 위한 약침용 제제 개발을 위한 소염효능 검증 실험결과, 봉독 추출물중 수용성 추출물에서 방풍은 에틸아세테이트 추출물에서 발목 부종, 신생 골증식, 연부조직종창 등의 억제와 더불어 혈중 IL-6농도를 감소시키는 등의 강력한 소염효과를 나타내었다.
2. 봉독 수용성 추출물 분획 1 (〉20kDa) 과 분획 3 (〈10kDa)에서 관절염에 대한 강력한 소염효과를 관찰하였으며, 방풍 분획중 방풍 에틸아세테이트 분획2에서 강력한 염증 억제 효과가 나타났다.
제 2 세부 과제
1. 봉독과 방풍 추출물중 봉독에서는 수용성 추출물에서 방풍은 에틸아세테이트 추출물에서 관절염시 나타나는 물리적 자극 또는 열자극에 대한 통증을 강력하게 억제하였으며, 이들 통증으로 인한 척수 내 Fos 단백질의 발현 또한 억제하여 관절염으로 유발된 통증을 억제시키는 것으로 관찰되었다.
2. 봉독 수용성 추출물중 분획 1(〉20kDa) 과 분획 3 (〈10kDa)에서 관절염으로 유발된 통증에 대해 강력한 진통효과를 나타내었으며, 방풍 에틸아세데이트 추출물의 분획 중에서는 분획 2에서 강력한 진통효과를 관찰하였다.
3. 이상의 결과에서 가장 뛰어난 소염 및 진통효능을 나타낸 봉독 수용성 추출물 분획 1과 3, 및 방풍 에틸아세테이트 추출물 분획 2를 이용한 일반 약리실험 결과 중추신경계, 위장관운동, 심맥관계 및 호흡기계의 정상적인 기능에 아무런 유의한 변화를 나타내지 않았으며, in vitro 실험에서 봉독 분획에 의해 장관 운동성이 감소되어 관찰되었으나, in vivo 실험결과와 종합하여 분석한 결과, 생체에서는 위장관 운동성에 유의한 변화를 나타내지 않았음을 확인하였다.
제 3 세부 과제
1. 봉독 물층 분획 B-F2 (IC$IC_{50}$ 0.42 ug/ml)와 B-F3 (IC$IC_{50}$, 0.16 ug/ml)은 LPS-induced J774A.1 murine macrophag cell에서 COX-2 선택적인 저해 활성을 보여주었으며 COX-1 저해 활성은 나타나지 않았다. 분획 B-Fl (IC$IC_{50}$, >20 ug/ml)은 COX-1, 2 모두 저해 활성을 나타내지 못했다.
2. 방풍 에틸아세테이트 분획 Fl (IC$IC_{50}$, 3.85 ug/ml)과 F2 (IC$IC_{50}$, 4.95 ug/ml)는 LPS-induced RAW 264.7 murine macrophage cell에서 NO 억제찰성을 보여주었다, 그러나 F3 (Icso, >10ug/ml)은 NO 생성을 억제하지 못하였다.
3. Cytokine 저해 활성 실험에서는 TNF-e의 경우, 봉폭 물층 분획(B-Fl, IC$IC_{50}$, 0.7 ug/ml B-F2, IC$IC_{50}$, 0.7 ug/ml, B-F3, IC$IC_{50}$, 0.6 ug/ml)과 방풍 에틸아세테이트 분획층(Fl, IC$IC_{50}$, 4.5 ug/ml; F2, IC$IC_{50}$, 4.0 ug/ml; F3, IC$IC_{50}$, 8.9 ug/ml) 모두 억제 효과를 보였고, IL-19의 경우는 봉독 물층 분획(B-Fl, IC$IC_{50}$, 1.8 ug/ml; B-F2, IC$IC_{50}$, 2.0 ug/ml; B-F3, IC$IC_{50}$, 1.6 ug/ml) 모두와 방풍 에틸아세테이트 분획층 Fl (IC$IC_{50}$, 6 ug/ml)와 F2 (IC$IC_{50}$, 5.5 ug/ml)에서 억제 활성을 보였고 F3 (IC$IC_{50}$, >10 ug/ml)분획은 활성을 나타내지 못했다.
4. Chemokine 억제 활성 실험에서는 봉독 물층, 방풍 에틸아세레이트층 모두 RANTES, SP, 그리고 opioid receptor에 대한 조절에 거의 관여하지 않는 것으로 나타났다.
제 4 세부 과제
1. 초대 배양한 근위세뇨관세포에서 protopanaxadiol saponins은 phospholipase A₂신호전달경로를 통하여 a-MG uptake 억제시켰으며 total ginsenosides, protopanaxadiol saponins, 및 protopanaxatriol saponins은 c-fos and c-jun 유전발현을 억제함으로써 EGF에 의한 세포증식을 억제시켰다.
2. 초대 배양한 근위세뇨관세포에서 봉독성분들 중 <10kDa 분획에 함유된 성분들이 phospholipase A₂-oxidative stress-$Ca^{2+}$ 신호전달경로를 통하여 세포생존율 및 솔변연 물질운반계 (a-MG, Pi, and $Na^+$ uptake) 활성을 억제시켰다.
제 5 세부 과제
유효성이 인정된 방풍과 봉독에 대하여 단회투여독성시험에 의한 반수치사량 산출, 28일간 반 복투여독성시험에 의한 용량반응관계 및 최대무작용량 산출, 국소독성여부를 확인하기 위한 피부자극시험 및 안점막자극시험, 면역원성을 확인하기 위한 항원성 시험을 통한 안전성 평가를 실시하였다. 단회투여독성시험, 반복투여독성시험, 국소독성시험 및 항원성시험을 통한 안전성 평가 결과, LD50와 무해용량(NOEL)은 Fl, F2, F3 각각 임상예정용량의 100배인 0.02 mg/kg, 100 mg/kg, 0.3 mg/kg 이상이고, 국소독성은 안점막 및 피부자극 모두 임상예정용량에서 자극이 없었으며, 항원성은 F3의 고용량인 0.09 mg/kg을 제외하고는 모두 항원성이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 결론적으로, Fl, F3(봉독)과 F2(방풍) 모두 임상예정용량인 0.0002 mg/kg, 1 mg/kg, 0.003 mg/kg에서는 독성이 없는 것으로 판단된다.
이러한 세부과제의 실험결과를 종합할 때, 골관절 질환을 치료하기 위해 약침용 소염진통제를 위한 약침제제로 봉독의 수용성 분획물중 분획 1(〉20kDa) 과 분획 3 (〈10kDa) 및 방풍 에틸 아세테이트 분획물중 분획2가 강력한 소염 및 진통효능을 나타내어 실제 임상에 약침제제로 사용이 가능할 것으로 판단된다. 뿐 만 아니라, 이들 분획물을 이용한 일반약리 및 독성검증을 통해 안전성을 평가한 결과 이들 물질들을 실제 임상에 사용할 때 안전성이 확보되는 것으로 관찰되었다.

Abstract ▼

We designed the experiments to evaluate the antinociceptive and anti inflammatory effect of several medical herb candidates such as bee venom and bang-poong that have been utilized for herbal drug acupuncture. In addition, we analyzed the safety of those candidates using In vivo and in vitro experim

We designed the experiments to evaluate the antinociceptive and anti inflammatory effect of several medical herb candidates such as bee venom and bang-poong that have been utilized for herbal drug acupuncture. In addition, we analyzed the safety of those candidates using In vivo and in vitro experiment. Finally, we tested general pharmacological effect of those candidates on central nervous system, gastrointestinal function, cardiovascular system and respiratory system. The experimental data were summerized as follows:
Project Division 1
1. Both aqua extract of bee venom (BVA) and ethylacetate extract of bang-poong (BAE) produceda strong anti-inflammatory effect (i.e. inhibition of paw edema, bone proliferation, and soft tissue swelling. decerase of serum t-6 level) on Freund's adjuvant induced arthritis In rats.
2. Fraction 1(〉20kDa) and 3(〈10kDa) from BVA and fraction 2 from BAE showed dramatic anti-arthritic effect on Freund's adjuvant-induced arthritis in rats.
Project Division 2
1. Aqua fraction of bee venom (BVA) and ethylacetate fraction of bang-poong (BAE) significantly suppressed both mechanical and thermal hyperalgesia induced by arthritis and decreased the spinal Fos expression evoked by arthritis.
2. Fraction 1(〉20kDa) and 3(〈10kDa) from BVA and fraction 2 from BAE produced strong antinociceptive effect on arthritis-induced pain.Project Division 3 1. Aqueous fractions of bee venom, B-F2 (IC$IC_{50}$, 0.42 ug/ml) and B-F3 (IC$IC_{50}$, 0.16 ug/ml) showed selective COX-2 inhibitory activity in LPS-induced J774A.1 murine macrophage cells, but not B-Fl (IC$IC_{50}$, >20 ug/ml) in COX-1 and -2.2. Ethyl notate fractions of Glehia littoralis FR Schmidt, M0191E-Fl (IC$IC_{50}$, 3.85 ug/ml) and M0191E-F2 (IC$IC_{50}$, 4.95 ug/ml) exhibited iNOS inhibitory activity in LPS-induced RAW 264.7murine macrophage cells. But not M0191E-F3.
3. We studied the inhibitory effects of subfractions from aqueous partition of bee venom on the production of LPS-induced TNF-Q(B-Fl, IC$IC_{50}$,0.7 ug/ml; B-F3, IC$IC_{50}$, 0.7 ug/ml; B-F3, IC$IC_{50}$, 0.6 ug/ml) and IL-1β (B-Fl, IC$IC_{50}$, 1.8 ug/ml; B-F2, IC$IC_{50}$, 2.0 ug/ml; B-F3, IC$IC_{50}$, 1.6 ug/ml) in PMA-treated U937 cells. In ethyl·actate fractions of Glehnia littoralis on the production of LPS-Induced TNF-a (M0191E-Fl, IC$IC_{50}$, 4.5 ug/ml; M0191E-F2, IC$IC_{50}$, 4.0 ug/ml; M0191E-F3, IC$IC_{50}$,8.9 ug/ml) and IL-β (M0191E-Fl, IC$IC_{50}$, 6 ug/ml; M0191E-F2, IC$IC_{50}$, 5.5 ug/ml; M0191E-F3, IC$IC_{50}$, >10 ug/ml) in PMA-treated U937 cells.
4. Aqueous fractions of bee venom and ethyl acetate fractions of Glehnia littoralis did not participated at regulation of chemokines (RANTES, SP) and opioid receptors (δ, μ & κ)
Project Division 4
1. Protopanaxadiol saponins inhibited a-MG uptake through phospholipase A₂signal pathway in primary cultured rabbit renal proximal tubule cells. In addtion, total ginsenosides, protopanaxadiol saponins, and protopanaxatriol saponins inhibited EGF-induced cell proliferation via decrease of c-fos and c-jun gene expression in primary cultured rabbit renal proximal tubule cells.〈10kDa among water soluble bee venom fraction decreases cell viability and apical transporters
2.〈10kDa among water soluble bee venom fraction decreases cell viability and apical transporters (α-MG, Pi, and $Na^+$uptake) activity, which associated with phospholipase A2-oxidative stress-$Ca^{2+}$'signal cascade in primary cultured rabbit renal proximal tubule cells.
Project Division 5
In this study, we evaluated the safety on oriental medicines such as bee venom(F1, F3) and Saposhnikovia divaricata (F2) extracts using single treatment toxicity test repeated treatment toxicity test, topical irritation test and antigenicity test. In the results, LD50 and no observed effect Level (NOEL) of Fl, E2, and F3 was more than 0.02, 100, and 0.3 mg/kg, respectively. Also, there are no irritative effects of Fl, F2, and F3 on experimental rabbits in eye and skin irritation test and no antigenicity effects of Fl, F2, and F3
except high dose of F3. In conclusion, Bee venom (Fl, F3) and Saposhnikovia divaricata (F2) extract may be not toxic under the condition of the clinical concentrations, 0.0002, 1, and 0.003 mg/kg, respectively.
In conclusion, fraction 1(〉20kDa) and 3(〈10kDa) from BVA as well as fraction 2 from BAE can be used to develop the herbal drug for acupuncture. Moreover, those candidates showed high safety through in vivo and in vitro safety analysis. Finally, those herbal drugs did not affect physiological functions including central nervous system, gastrointestinal function, cardiovascular system and respiratory system.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...13
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...17
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...19
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...24
• 6.첨부서류...25
• Ⅲ. 제1세부연구개발과제 연구결과...109
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...110
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...110
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...113
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...121
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...124
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...125
• 7. 참고문헌...126
• Ⅲ. 제2세부연구개발과제 연구결과...128
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...129
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...129
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...133
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...148
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...150
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...151
• 7. 참고문헌...152
• Ⅲ. 제3세부연구개발과제 연구결과...154
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...155
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...156
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...159
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...162
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...164
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획...165
• 7. 참고문헌...166
• Ⅲ. 제4세부연구개발과제 연구결과...170
• 1. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...171
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...172
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...175
• 4. 제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...178
• 5. 제4세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...182
• 6. 제4세부연구개발과제의 활용계획...183
• 7. 참고문헌...184
• Ⅲ. 제5세부연구개발과제 연구결과...189
• 1. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...190
• 2. 제5세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...191
• 3. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...206
• 4. 제5세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...216
• 5. 제5세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...257
• 6. 제5세부연구개발과제의 활용계획...258
• 7. 참고문헌...259