보고서 정보
주관연구기관 |
연세대학교 Yonsei University |
연구책임자 |
이현철
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참여연구자 |
정만길
,
김종선
,
김경래
,
김현만
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2002-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
연세대학교 Yonsei University |
등록번호 |
TRKO200300001502 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
당뇨병.치료.예방.Diabetes.Treaeent.Prevention.
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초록
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1. 연구목적 : 본 연구과제의 목표는 첫째 생약인 단삼으로부터 유효물질을 추출하여 그 효과를 연구하고 당뇨병성 만성합병증의 예방 및 치료제로 쓸 수 있는 신약개발의 연구기반을 이루고 새로운 인슬린 감작제를 탐색하고 개발하고자 하였고, 둘째 가족력이 강한 당뇨병 환자를 대상으로 후보 유전자를 검색하고 당대사의 장애를 연구하여 한국인 당뇨병 환자를 병인론적 측면에서 분류를 추구하고, 한국인 당뇨병 환자의 임상적 특성에 맞게 쳬장베타세포의 인슬린 분비능 감소정도와 인슬린 저항성의 기준을 정하고 치료법을 적용하여 혈당 및 혈관위험요소 관
1. 연구목적 : 본 연구과제의 목표는 첫째 생약인 단삼으로부터 유효물질을 추출하여 그 효과를 연구하고 당뇨병성 만성합병증의 예방 및 치료제로 쓸 수 있는 신약개발의 연구기반을 이루고 새로운 인슬린 감작제를 탐색하고 개발하고자 하였고, 둘째 가족력이 강한 당뇨병 환자를 대상으로 후보 유전자를 검색하고 당대사의 장애를 연구하여 한국인 당뇨병 환자를 병인론적 측면에서 분류를 추구하고, 한국인 당뇨병 환자의 임상적 특성에 맞게 쳬장베타세포의 인슬린 분비능 감소정도와 인슬린 저항성의 기준을 정하고 치료법을 적용하여 혈당 및 혈관위험요소 관리를 합으로써 미세혈관 및 대혈관 차병증 발생을 최소화시킬 수 있는 표준치료지침을 수립하고자 하였다. 2. 연구방법 본 연구과제는 2개의 세부과제와 3개의 공동연구과재로 구성되었다.1세부과제 : 단삼의 활성 추출물과 이의 활성 성분 분리에 착수하여, 추출물에서 당뇨 쥐의 신증 치료와 단백뇨 감소에 매우 효과가 있는가를 확인하고, 활성 추출물로부터 유효 활성 성분 분리 및 분리법 개발, 유효 성분의 구조 확인과 약리 작용을 확인하고, 이러한 효과는 어떤 기전으로 나타나는지를 in vitro study를 통하여 규명하였다. 또한, PTP-lB가 인슬린 감수성에 어떤 기전으로 작용을 하는지를 알아보기 위해, PTP-lB의 PTP 활성부위(PTP domain)를 PCR을 이용하여 cloning, PTP-lB domain의 대량 발현 및 순수 정제, PTP 활성 및 PTP-ligand 결합의 assay system 구축, PTP-lB의 sequence motif 변형시켜 PTP-lB의 inhibitor 탐색, PTP의 inhibitor를 시험하고(in vitro test), PTP-lB, -lC. -lD의 protein tyrosine phosphatase domain (PTPD) 클로닝, 대량발현, 순수정제를 하였다. 2세부과제 : 한국인 당뇨병 환자의 표준치료지침을 개발하기 위해 당뇨병 환자를 대상으로 인슬린분비능와 저항성을 측정하여 혈당조절 정도와 죽상경화증 정도와의 관계를 보았으며, 이를 토대로 당뇨병 표준치료모형을 개발하고 유용성을 입증하기 위한 연구를 수행하였다. 또한 가족력이 있는 한국인 당뇨병의 병인의 다양성에 대하여 조사하고자 가족력이 있는 한국인 당뇨병 환자 및 가족들을 대상으로 임상적 특성, 베타세포 관련 항체, 인슬린 분비능, 인슬린 저항성을 조사하고 관련되는 유전적 결함을 검색함으로써 당뇨병의 다양성을 원인적으로 세분하고 전형적인 유전성에 대하여 연구하고자 하였으며, 이에 대한 유전자 변이 여부를 확인하고자 하였다. 3. 연구결과1세부과제 : 단삼의 추출물에서 당뇨쥐의 신증 치료와 단백뇨 감소에 효과가 있음을 확인하였고, 이러한 작용을 나타내는 활성추출물로부터 유효활성성분인 lithospermate B를 순수 분리하였다. 그 기전적인 측면에서 aldose redutase 활성을 억제하는 것과 fibronectin의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 단삼추출물인 LAB를 mouse mesangial cell 에 처리해 본 결과, 가장먼저 증가되어 진다고 생각되는 ROS 의 증가를 억제함을 밝혔고, 그 이하의 여러 가지 signal molecule 등의 변화를 관찰하였다. ROS가 직접적으로 PKC를 activation 하거나 PKC가 directly ROS를 증가시킨다는 보고는 아직 없지만, 두 종류의 synergic effect를 통한 signal 의 증가를 LAB 가 막는 것을 밝혔고, PKC는 cytosol 에 있다가 membrane 으로 이동하면서 activation 된다고 알려져 있는데, membrane fraction 에 있는 PKC 만을 선택적으로 inhibition 함으로 인해 당뇨에 선택적으로 작용할 것으로 생각된다. 그리고, PKC protein 에 directly 작용함으로 인해 ROS를 저해한다고 생각되어진다. 또한 aldose reductase 의 activity를 억제함으로 인해 삼투압의 증가를 같이 막음으로 인하여, 당뇨병성 신증이 일어날 수 있는 여러 가지 가능성을 배제함을 알았다. 공동연구과제(1)를 통해 LAB를 역상 크로마토그래피를 이용하지 않고 값싼 플래쉬 크로마토그래피를 이용해 분리하는 방법을 개발함으로서 짧은 시간에 많은 양의 LAB를 얻어낼 수 있개 되었고, LAB가 당뇨병 발생 기전의 여러 부분에 대해 모두 효과가 있음이 알려졌으며, 기존에 알려진 aldose reductase 저해 활성까지 고려하면 LAB는 당뇨병 및 당뇨병성 신증 치료에 매우 효율적인 물질로 판단하였다. 4종의 식물(육두구, 까마중, 작약, 당귀) 추출물이 PTP-lb 억재 효과가 뛰어난 것을 확인하여 추후 성분 분리를 통해 활성이 높은 물질 추출 가능성을 확인하였다. LAB및 그 유도체 합성 연구를 통해 여러 종류의 유도체를 합성하였으며, 그 약효를 검색하여 구조-약효 상관관계 분석을 위한 기초 자료를 확보하였다. 계산화학 및 분자 모델링을 이용한 분자 디자인을 통해 높은 활성을 보일 것으로 예상되는 물질을 도출하였으며, 이 물질을 합성하여 약효를 측정하고 ,QSAR과 docking simulation을 통해 디자인을 검증하고 더욱 정교하게 디자인을 할 수 있는 기반을 마련하였다. 공동연구과제(2)를 통해 PTP-lB와 SHP-1의 catalytic domain을 포함하는 유전자 부위를 클로닝하여 대장균내에서 대량 발현시키고 PTP-lB와 SHP-1 단백질을 순수 정재하였으며, vanadate, molybdate, tungstate가 효과적인 PTP-lB 저해제임을 확인하였다. 제2세부과제 : 당뇨병 환자를 치료방법과 혈당쪼절 정도를 비교분석한 결과 공복시 c-peptide 농도에 따라 혈당조절 정도가 결정됨을 알 수 있었고, 혈당조절이 잘 되는 군에서 미세혈관합병증이 적음을 관찰하였다. 또한 인슐린저항성이 동반된 경우는 혈당조절정도에 관계없이 총경동맥의 내중막두께가 증가되어 있고 하지-상완 혈압비의 감소소견을 보였다. 이상의 관찰을 토대로 인슐린 분비능에 따른 혈당조절 정도를 평가하기 위해 식사/운동요법만으로 혈당조절을 시도하는 연구와 설폰요소제만으로 혈당조절을 시도하는 연구를 수행하여 공복 c-peptide가 1.7ng/dL 이하인 경우는 식사/운동요법만으로는 혈당조절이 되지 않음을 알았고, c-peptide가 1.Ing/dL 이하인 경우는 인슐린치료가 필요함을 알 수 있었다. 또한 인슐린저항성이 있는 환자를 대상으로 설폰요소제와 메트포민 비교임상을 수행하여 인슬린저항성이 있는 환자의 경우는 인슐린저항성 개선제를 일차적으로 사용함이 대혈관합병증 진행을 막는데 유효함을 알 수 있었다. 결과적으로 인슐린 분비능에 따라 3군으로, 인슐린저항성에 따라 2군, 총 6군으로 나눌 수 있었으며, 각각의 치료방침을 달리하는 한국인 제2형당뇨병 환자의 표준치료지침을 개발하였다. 표준치료지침의 임상적 유용성을 평가하기 위한 연구에서 표준치료지침을 적용한 후 공복 혈당, 식후 혈당, 당화혈색소, 확장기 혈압, 중성지방, AST, ALT가 유의하게 감소하였고, 혈당 조절에 성공한 군 (responder group)이 치료 시행 전 $28.4\%$에서 치료 시행 후 $51.4\%$로 증가하였다. 따라서 본 연구에서 제시한 한국인 제2형 당뇨병 환자의 표준치료지침은 당조절 뿐 아니라 지질대사이상, 고혈압 치료에도 효과가 있었다. 공동연구과제(1)에서는 가족력이 있는 한국인 제2형 당뇨병 환자들을 인슐린 분비능 및 저항성에 따라 분류함으로써 병인론적 의미를 찾고자 하였으나 유의한 특성을 발견할 수 없었으나 이들에게서 인슐린 분비능 장애가 심함을 확인하였기 때문에 이들을 치료함에 있어서 인슐린 분비능 개선 및 인슐린 보충이 우선적으로 고려되어야 할 것으로 결론지을 수 있겠다. 또한 이들에게서 HNF-l/sub a/ 및 HNF-4/sub a/ 운전자 검색에서 새로운 돌연변이를 발견하였는데 이로써 한국인 제2형 당뇨병의 발생에 있어서 유전적 결함의 가능성을 확인하였다는 의미가 있다고 하n 다. 그러나 아직 결정적인 유전자 결함은 발견되지 않았으며 가족력이 강한 경우에서도 식생활, 비만 등 환경적 요인이 중요하게 관여될 것으로 사료되며 따라서 이들에게서 규칙적인 생활 등 환경적?상의 내용들은 한국인 당뇨병 환자들의 병인론적 연구로써 이들에 대한 적절한 치료의 방향을 정하는데 도움이 될 자료를 구축하였다.
Abstract
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1. Objectives : Thefinal goal of this project has two aspects as followings : one is to study the effectiveness of the extracts from natural herbage, Ginseng and to find out a new insulin sensitizer for the treatment and prevention of chronic complications of diabetes, the other is to find candidate
1. Objectives : Thefinal goal of this project has two aspects as followings : one is to study the effectiveness of the extracts from natural herbage, Ginseng and to find out a new insulin sensitizer for the treatment and prevention of chronic complications of diabetes, the other is to find candidate gene in Korean diabetes families, to classify the pathophysiologyof Korean diabetes and to make a standardized therapeutic guideline for proper sugar control and risk of vascular accident management according to the clinical characteristics of impaired insulin secretory capacity and increased insulin resistance of Korean diabetic patient.2. Methods and results The First sub-project : Separated active component from crude extracts of Ginseng was confirmed for effectiveness on the treatment of diabetic nephropathy and the improvement in diabetic mouse. The separation of effective active component revealed lithospermate B(LAB). The mechanism is composed of inhibition of aldose reductase activity and fibronectin synthesis. Inhibition of initial increasingevent of ROS and changing several signal molecules under the pathway were noted in the diabetic mesangial cell with LAB, extract. The first associated study project : The LAB separation method was developed by flash chromatography with lower price compared with () chromatography. The possibility of extracting active PTP-lB inhibito component from 4 species of plant (yugdugu, kamajung, jakyak, dangui) was noted. Several derivatives were made from the result of study for LAB and its property. The second associated study project : PTP-lB and SHP-1 were purified from the media with E. coli expressing catalytic domain of PTP-lB and SHP-1 after cloning procedure of these genes. Vanadate, molybdate and tungstate were confirmed to have effective PTP-lBl inhibitory property. The Second sub-project : Study for diabetes management and glycemic control revealed that premeal C-peptide level reflect glycemic control in diabetics, and well controlled diabetics have lower microvascular complication rate. In the insulin resistant group, intima-media thickness of common carotid artery was increasedand ankle-brachial pressure index was decreased. According to the insulin secretion capacity, diet-exercise treatment was enable to proper sugar control in the group below 1.7ng/dL of premeal C-peptide level, however, insulin therapy was needed in the group below 1.1ng/dL of premeal C-peptide level. Initial choice of insulin sensitizer was effective on the prevention of macrovascular complication in insulin resistant group. These standardized therapeutic guideline is adjusted for Korean type 2 diabetic patients and these therapeutic outcome revealed significant effect on glycemic control, improvement of abnormal lipid metabolism and management of hypertension through decreasing sugar, HbAlc, diastolic blood pressure and triglyceride levels. The first associated study project : Classification of Korean type 2 diabetic families by insulin secretion capacity and resistance cannot explain the specific properties oil pathophysiology. And, newly noted mutation in researchof HNF-la and HNF-4a gene was meaningful in the fact that there is a possibility of Korean type 2 diabetic genetic abnormality.
목차 Contents
- I. 연구개발결과 요약문...4
- (한글) 홍화씨에서 분리한 폴리페놀 화합물의 뼈조직 보호작용...4
- (영문) Bone protecting effects of polyphenols extracted from safflower seeds...5
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...6
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...8
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...9
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...14
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...16
- 6. 첨부서류...16
- 6-1. The Korean Jounal of Physiology and Pharmacology에 출판 논문...17
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