유기인계 농약 파라티온-메틸에 대한 항체생산과 분석용 ELISA 개발 Production of antibody to organophosphate pesticide parathion-methyl and development of its analytical ELISA원문보기
- 연구개발의 내용 및 범위 1. Hapten 및 항원합성 2. 다클론항체 생산 및 ELISA 개발 3. 단클론 팡체 생산을 위한 hybridoma개발 4. 단클론항체를 이용한 ELISA 개발 5. 신속 효소면역분석시스템 개발 6. 개발한 ELISA의 식품시료의 적용 및 분석 가능성 조사 - 연구내용 및 결과 1. Hapten 및 항원합성: ①PM 구조의 benzene 고리부분을 보존한 채 thiophosphaterl의 methoxyl기 중 하나를 sm
- 연구개발의 내용 및 범위 1. Hapten 및 항원합성 2. 다클론항체 생산 및 ELISA 개발 3. 단클론 팡체 생산을 위한 hybridoma개발 4. 단클론항체를 이용한 ELISA 개발 5. 신속 효소면역분석시스템 개발 6. 개발한 ELISA의 식품시료의 적용 및 분석 가능성 조사 - 연구내용 및 결과 1. Hapten 및 항원합성: ①PM 구조의 benzene 고리부분을 보존한 채 thiophosphaterl의 methoxyl기 중 하나를 sminocarboxylic acid(bridge)로 치환하여 사슬길이가 다른 2가지 hapten을 합성하여 NMR 및 IR로 그 합성을 확인: ②Hemisuccinate active ester화 시켜 BSA, KLH 및 OVA를 결합시켜 면역원 및 코팅항원으로 사용: ③구조가 다른 4가지 hapten에 OVA를 결합 후 코팅항원으로 사용 2. 다클론 항체생성 및 ELISA 최적화: (1)면역항원은 토끼 0.5 mg/0.5mL/rabbit로 피하주사, anti-serum을 얻어 PAb로 사용; (2) PAb를 이용한 indirect competitive ELISA(IC-ELISA) 개발-PAb(PM-C-BSA immunized, 278(1:1000)에 의한 IC-ELISA의 조건은 항원코팅(E-OVA 25 ng/well) 및 blocking(1% gelatin) 후, 검량곡선을 수립(IC50=6.4 ppb, 검량범위=0.1∼1000 ppb, 검출한계=0.2 ppb). (3)교차반응성은 parathion 6.7, Fenitrothion 2.7, Paraoxon 4.5%을 제외하고는 11종의 이성체들과는 반응성이 없음. 3. 단클론 항체생성 및 ELISA 최적화: (1)PM에 대하여 특이성과 민감성이 높은 융합세포를 cloning 한 후 10종의 hybridoma cell line을 구축. (2)10종의 MAb 중 1H2(1:10,000)와 코팅항원 (PM-C-OVA 25 ng/well) 조건을 이용하여 ELISA를 최적화 한 후 검량곡선을 수립(IC50=2.3 ppb). 교차반응성은 Parathion 25.7, EPN 10, fenitrothion 12.5%를 제외하고는 반응성이 1% 미만. 4. 신속검색 효소면역분석법 개발 및 응용: (1)Direct competitive ELISA를 실시하였을 경우 90분 안에 1 ppb 이상 식품에 오염된 PM의 검출 가능. (2)농산물 중 곡류, 두류, 채소류 및 과일류와 농경지 토양 및 하천수에서 0.5 ppm 및 1 ppm으로 PM을 첨가하여 80% MeOH로 추출하여 전처리 없이 PBS(pH 7.4)로 희석하여 분석한 결과 각각 86-110%의 회수율을 보임. (3)기기분석과의 상호비교 결과 r2=0.97정도로 높은 상관성을 가지는 것으로 나타남. (4)40점의 농경지 토양 및 하천수, 강물, 농수 등에서 PM의 오염여부를 검출한 결과, 농경지 2점에서 0.5 및 5 ppm 정도 오염되어 있는 것으로 측정. - 연구개발결과의 기대효과 및 활용계획 1. 합텐 합성방법-유기인계 농약의 검출을 위한 다른 면역분석법개발에 이 기법을 활용함; 2. 지속적 항체생산이 가늠한 세포주를 이용하여 언제 어디서나 누구라도 사용이 가능한 KIT 개발이 생산체계로 연결된다면, 보다 효과적으로 잔류농약을 모니터링 활용이 가능할 것으로 기대.
Abstract▼
o SCOPES AND CONTENTS OF THE STUDY 1. Synthesis of hapten and antigen 2. Production of polyclonal antibodies(PAbs) and development of ELISA 3. Development of hybridoma cell line for production of monoclonal antibodies(MAbS) 4. Development of ELISA based on MAbs 6. Application if devel
o SCOPES AND CONTENTS OF THE STUDY 1. Synthesis of hapten and antigen 2. Production of polyclonal antibodies(PAbs) and development of ELISA 3. Development of hybridoma cell line for production of monoclonal antibodies(MAbS) 4. Development of ELISA based on MAbs 6. Application if developted ELISA for feed samples and investigation of analytical abailable o CONTENTS AND RESUTS OF THE STUDY 1. Syntesis of hapten and antigen: (1)Two haptens (PM- A and C) which differ in length of the bridge placed at the thiophosphate group of parathion-methyl(PM) were synthesized and conformed by NMR and IR (2)Haptens were conjugated to BSA and/or KLH for immunogens and OVA for coating antigens. (3)Four different haptens (PM- D, E, F and G) were synthesized and were conjugated to OVA to be used as competitors. 2. Production of PAbs and optimum of ELISA: (1)PAbs were obtained from immunized New Zealand white rabbits antisera (2)Antisera 278(1:1000), against hapten C-BSA, and coating antigen hapten R-OVA (25 ng/well) and 1% gelatin as a blocking agent. Standard curves for PM were obtained(IC50=6.4 ppb, Working range=0.1-1000 ppb and detection limit=0.2 ppb), (3)The ELISA showed negligible cross-reactivity(CR%) with other organophosphorous pesticides except with parathion(6.7%). 3. Production of MAbs and optimum of ELISA: (1)Construction of 10 kinds of hybridoma cell line, which production of high sensitive and specificitive MAbs against PM (2)Using of PM-C-OVA as coating antigen (25 ng/ml) and MAb 1H2 (dilution 1:10000) allowed to receive the best assay results(the range of 1-1000 ppb, IC50 being 2.3 ppb. Detection limit was 0.2 ppb). The CR% with structurely related compounds to PM was observed for parathion(25%), EPN (10%) and fenitrothion (12.5%): for other organophosphorous pesticides it was less than 1%. 4. Development of rapid screening ELISA and Application: (1)Within 90 min, contamination of PM on food, more than 1 ppb, were detectable by direct competitive ELISA.(2)Spiked 0.5 and 1 ppm samples (grains, beans, fruits, vegetables, and soil) were extracted with 80% MeOH and applied ELISA system, without clean-up. (3)Recovery averaged between 86 and 110 %. It shown as high relationship with instumental analysis(r2=0.97) (4)Application to screening of contamination of PM on soil and environmental water, Among 40 samples, two samles were detected more than 0.5 and 5 ppm. o SUGGESTION FOR APPLICATION OF THE RESULT 1. Application of synthesis of hapten. 2. Development of ELISA KIT
목차 Contents
II. 연구개발과제 연구결과...8
1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
1) 연구개발의 필요성과 배경...8
(1) 연구의 필요성...8
(2) 국내·외 관련기술의 현황...13
2) 연구개발의 목표 및 범위...14
(1) 연구개발의 목표...14
(2) 연구개발의 내용 및 범위...14
2. 연구개발과제의 최종 연구개잘 내용 및 결과...17
1) 실험 재료...19
(1) 시약 및 실험 재료...19
(2) 사용기기...20
2) 실험 방법...20
(1) Parathion-methyl의 hapten 합성...20
① 면역원 hapten 합성...20
② 코팅 항원을 위한 hapten 합성...23
(2) 항원(Hapten-protein conjugate)의 합성...27
① Active ester의 합성...27
② Hapten-Protein conjugation...29
③ 효소표지 tracer(parathion-methyl HRP)...30
(3) Parathion-methyl에 대한 polyclonal antibody 생산 및 ELISA 최적화...31
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