보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 Seoul National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2007-05 |
과제시작연도 |
2006 |
주관부처 |
농림부 Ministry of Agriculture and Forestry |
등록번호 |
TRKO201400022876 |
과제고유번호 |
1380000135 |
사업명 |
농림기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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초록
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○ 연구결과
가. Metamifop의 ELISA 분석법 개발
Metamifop의 구조를 모방한 hapten 5종(A,B,C,D,E)을 합성하여 KLH와 BSA에 접합시켜 각각 면역원과 코팅항원으로 사용하였다. 다양한 면역원과 코팅항원 조합을 확인한 결과 D-BSA를 코팅항원으로 사용하고 A-KLH를 면역원으로 얻어진 항체를 이용하였을 때, 가장 높은 감도를 보였다. 따라서 위의 조건에 대한 용매 (acetone, acetonitrile, methanol), pH, 이온 농도, 세제의 효과를 확인하여 최적화 시켰다. 최적화
○ 연구결과
가. Metamifop의 ELISA 분석법 개발
Metamifop의 구조를 모방한 hapten 5종(A,B,C,D,E)을 합성하여 KLH와 BSA에 접합시켜 각각 면역원과 코팅항원으로 사용하였다. 다양한 면역원과 코팅항원 조합을 확인한 결과 D-BSA를 코팅항원으로 사용하고 A-KLH를 면역원으로 얻어진 항체를 이용하였을 때, 가장 높은 감도를 보였다. 따라서 위의 조건에 대한 용매 (acetone, acetonitrile, methanol), pH, 이온 농도, 세제의 효과를 확인하여 최적화 시켰다. 최적화 조건에서 ELISA 분석법의 IC50은 20.1 ng/ml, 최소 검출농도는 0.1 ng/ml , 직선 검량범위는 1.0 ~ 350 ng/ml 이었다. 교차반응성 확인 결과, 비슷한 구조를 포함하고 있는 fenoxaprop-P-ethyl (104.2 %)와 fenoxaprop-P (56.4%)에 대하여 교차반응성을 보였다.
논물 중 metamifop 분석을 위한 ELISA 분석법의 IC50은 142.6 ng/ml, 최소 검출농도는 5.0 ng/ml , 직선 검량범위는 18.0 ~ 3500 ng/ml 이었고, 회수율은 84.67 ~ 117.00% 이었다. 토양 중 metamifop 분석을 위한 ELISA 분석법의 IC50은 98.5 ng/ml, 최소 검출농도는 3.0 ng/ml , 직선 검량범위는 10.0 ~ 900 ng/ml 이었고, 회수율은 86.66 ~ 96.00% 이었다. 현미 중 metamifop 분석을 위한 ELISA 분석법의 IC50은 266.7 ng/ml, 최소 검출농도는 5.0 ng/ml , 직선 검량범위는 20.0 ~ 3360 ng/ml 이었고, 회수율은 94.83 ~ 118.78% 이었다.
HPLC를 이용한 물, 토양, 현미 중 분석법은 검출 한계(LOD)는 50 ng/ml 이었고, 회수율은 91.31 ~ 93.23%를 나타내었다.
X-ray crystallograpy를 이용한 metamfop 3차원 결정 구조는 propionic acid결합을 기준으로 구부러진 모양을 보였고, 분자 모델링을 통한 연구에서도 유사한 결과를 나타내었다.
나. Bistrifluron의 ELISA 분석법 개발
Bistrifluron의 구조를 모방한 hapten 5종(I, II, III, IV, V)을 합성하여 I-KLH를 면역원으로 사용하고, I, II III, IV, V-BSA를 코팅항원으로 사용하였다. I-KLH 면역원에 대해 다양한 면역원과 코팅항원 조합을 확인한 결과 V-BSA를 코팅항원으로 사용하였을 때, 가장 감도가 높게 나왔다. 따라서 위의 조건에 대한 용매 (acetone, methanol), pH, 이온 농도, 세제의 효과를 확인하여 최적화 시켰다. 최적화 조건에서 ELISA 분석법의 IC50은 82.0 ng/ml, 최소 검출농도는 0.5 ng/ml , 직선 검량범위는 1.0 ~ 500 ng/ml 이었다. 교차반응성 확인 결과, 다른 benzoylurea 살충제에 대하여 교차반응성이 없는 것으로 확인되었다. 논 물, 토양, 배추 중 bistrifluron 분석을 위한 ELISA 분석법을 확인한 결과 높은 농도에서 저해가 일어나지 않았다. 이는 bistrifluron의 낮은 수용해도 때문인 것으로 판단된다.
HPLC를 이용한 물, 토양, 배추 중 분석법은 검출 한계(LOD)는 250 ng/ml 이었고, 회수율은 90.64 ~ 98.09%를 나타내었다.
X-ray crystallography를 이용하여 5 개의 benzoylphenylurea 살충제 bistrifluron, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, hexaflumuron의 3차원 결정 구조를 동정하였다. Bistrifluron 3차원 결정 구조는 urea 결합이 분자내 수소 결합을 통하여 안정화되고, 고리의 구조를 취하고 있는 것으로 확인 되었고, 다른 benzoylurea 살충제도 같은 경향을 나타내었다. 분자 모델링을 통한 연구에서도 유사한 결과를 나타내었다.
다. Ethaboxam의 ELISA 분석법 개발
Ethaboxam의 구조를 모방한 hapten 4종 (1,2,3,4)을 합성하여 KLH와 BSA에 접합시켜 각각 면역원과 코팅항원으로 사용하였다. 다양한 면역원과 코팅항원 조합을 확인한 결과 민감하게 저해되는 조합은 없어, 다른 종류의 hapten design과 합성 및 항체생성이 시도되어야 할 것으로 판단된다.
HPLC를 이용한 물, 오이 중 분석법은 검출 한계(LOD)는 10 ng/ml 이었고, 회수율은 75.38 ~ 93.08%를 나타내었다.
Ethaboxam은 하나의 chiral carbon과 다양한 위치에 회전이 용이한 결합을 가지고 있어 crystal 생성이 어려웠다. 따라서 분자 모델링을 통하여 3차원 구조 해석을 시도하였다.
Abstract
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1. Results
1). Development of an ELISA for metamifop
Five haptens (A,B,C,D,E) which are structurally related to metamifop were synthesized. Haptens were conjugated to keyhole lymphet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin and they were used as immunogens and plate-coating antigen, respectiv
1. Results
1). Development of an ELISA for metamifop
Five haptens (A,B,C,D,E) which are structurally related to metamifop were synthesized. Haptens were conjugated to keyhole lymphet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin and they were used as immunogens and plate-coating antigen, respectively. Various set of antibodies and the coating antigens were screened for ELISA. A selected heterologous system with coating antigen D-BSA and immunogen A-KLH was established to show an IC50 as low as 20 ng/ml, and detection limit of 0.1 ng/ml with detection range of 1.0 ~ 350 ng/ml after optimization procedures with solvent (acetone, acetonitrile, methanol), pH, ionic strength, detergent. The cross-reactivity of other related herbicide were less than 0.5% in the assay except fenoxaprop-P (56.4%) and fenoxaprop-P-ethyl (104.2%). ELISA for the metamifop residue in paddy water showed an 50 of 142.6 ng/ml, and detection limit of 5.0 ng/ml with detection range 18.0 ~ 3,500 ng/ml and recoveries of 84.67% ~ 117.00%. ELISA for the metamifop residue in soil showed an IC50 of 98.5 ng/ml and detection limit of 3.0 ng/ml with detection range of 10.0 ~ 900 ng/ml and recoveries of 86.66% ~ 96.00%. ELISA for the metamifop residue in brown rice showed an IC50 of 266.7 ng/ml and detection limit of 5.0 ng/ml with detection range of 20.0 ~ 3,360 ng/ml and recoveries of 94.83% ~ 118.78%.
The HPLC analytical method for metamifop residues in paddy water, soil, and rice showed detection limit of 50 ng/ml and recoveries of 91.31% ~ 93.23% 3-Dimensional structure of metamifop by X-ray crystallography determined and the result showed U-shape bend on propionic acid moiety. The molecular modeling showed the similar results.
2). Development of an ELISA for bistrifluron
Five haptens(I, II, III, IV, V) structurally related to bistriflruon were synthesized. Hapten I conjugated to keyhole lymphet hemocyanin (KLH) was used as immunogen and hapten I, II, III, IV, V were conjugated to bovine serum albumin to use as plate-coating antigen, respectively. Various set of antibodies and the coating antigens were screened for ELISA. A selected heterologous system with coating antigen V-BSA and immunogen I-KLH was established to show an IC50 as low as 82.0 ng/mland detection limit of 0.5 ng/ml with detection range 1.0 ~ 500 ng/ml after optimization procedures with solvent (acetone, acetonitrile, methanol), pH, ionic strength, detergent. The cross-reactivity of other benzoylphenylurea insecticide was less than 0.5%. ELISA for the bistrifluron residue in paddy water, soil and chinese cabbage showed little inhibition at high concentration of bistrifluron because of its low water solubility.
The HPLC analytical method for bistrifluron residues in paddy water, soil, and chinese cabbage showed detection limit of 250 ng/ml and recoveries of 90.64% ~ 98.09%.
3-Dimensional structure of 5 benzoylphenylurea insecticides including bistrilfuron, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, and hexaflumuron were determined by X-ray crystallography and bistrilfuron showed intramolecular hydrogen bonding to stabilize the structures. Other 4 benzoylphenylurea insecticides showed similar results and the molecular modeling confirmed similarities.
3). Development of an ELISA for ethaboxam
Four haptens (1,2,3,4) structurally related to ethaboxam were synthesized. Haptens were conjugated to keyhole lymphet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin and they were used as immunogens and plate-coating antigen, respectively. Various set of antibodies and the coating antigens were screened for ELISA. Unfortunately, every system was not inhibited by ethaboxam. Therefore, further investigations by new hapten design and synthesis and antibody production are necessary.
The HPLC analytical method for ethaboxam residues in paddy water and cucumber showed detection limit of 10 ng/ml and recoveries of 75.38% ~ 93.08%.
For the 3-dimensional structure determination of ethaboxam crystal was not formed because ethaboxam has one chiral carbon and many freely rotating bond. Therefore, 3-dimensional structure was studied with molecular modeling.
목차 Contents
- 제 출 문 ... 1
- 요 약 문 ... 2
- SUMMARY ... 5
- CONTENTS ... 8
- 목 차 ... 9
- 제1장. 연구개발 과제의 개요 ... 10
- 제1절. 연구개발의 목적 ... 10
- 제2절. 연구개발의 필요성 ... 10
- 제3절. 연구개발의 범위 ... 11
- 제2장. 국내외 기술 개발 현황 ... 13
- 제3장. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 14
- 제1절. 연구수행 방법 ... 14
- 제2절. Metamifop의 ELISA 분석법 개발 내용 및 결과 ... 18
- 제3절. Bistrifluron의 ELISA 분석법 개발 내용 및 결과 ... 57
- 제4절. Ethaboxam의 ELISA 분석법 개발 내용 및 결과 ... 99
- 제4장. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 120
- 제5장. 연구개발 결과의 활용계획 ... 121
- 제6장. 연구개발 과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 122
- 제7장. 참고문헌 ... 123
- 끝페이지 ... 125
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