초록 ▼

기니픽을 이용한 피부감작시험인 Guinea pig maximization test(GPMT)의 대체시험e법으로 local lymph node assay(LLNA)이 대두되고 있지만, 이 방법은 방사선 물질을 사용하기 때문에 비방사선 시험법이 요구되고 있다. 본 실험은 LLNA 시험을 비방사선으로 접근할 수 있는지를 파악하기 위하여 Bromodeoxyuridine(BrdU)를 이용한 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 방법으로의 가능성을 파악하고 Flowcytometry(FCM)를 이용한 생체지표

기니픽을 이용한 피부감작시험인 Guinea pig maximization test(GPMT)의 대체시험e법으로 local lymph node assay(LLNA)이 대두되고 있지만, 이 방법은 방사선 물질을 사용하기 때문에 비방사선 시험법이 요구되고 있다. 본 실험은 LLNA 시험을 비방사선으로 접근할 수 있는지를 파악하기 위하여 Bromodeoxyuridine(BrdU)를 이용한 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 방법으로의 가능성을 파악하고 Flowcytometry(FCM)를 이용한 생체지표 물질을 검색하고자 하였다. 아울러 피부미백화장품 원료에 대하여 LLNA법에 의한 피부감작성시험을 실시하고자 하였다. 비 방사선 시험법중에서 접근이 용이한 ELISA 방법의 가능성을 파악하기 위하여 감작성 물질로서 DNCB(2, 4-dinitrochlolobenzene), TDI(toluene diisocyanate), OXZ(oxazolone), HCA(${\alpha}$-hexylcinnamaldehyde), 자극성 물질로서 SLS(sodium lauryl sulfate)를 시험물질로 하여 LLNA 시험을 실시하였다. BrdU를 투여하여 ELISA 방법으로 측정한 SI(stimulation index)는 강한 접촉 알러젠인 DNCB 군(0.25, 0.5, 1%)에서 각각 3.6, 3.6, 4.3으로 나타나 모두 양성으로 관찰되었고, 강한 호흡 알러젠인 TDI 군(0.5, 1, 2%)에서는 4.5, 4.8, 4.9로 관찰되어 모두 양성반응으로 판정되었다. 또 다른 접촉 알러젠인 OXZ 군(0.25, 0.5, 1%)에서는 각각 2.1, 2.3, 2.7로 나타나 유의성 있게 증가하였다. 그러나 약한 알러젠인 HCA군(10, 20, 30%)에서는 1.7, 1.9, 2.1로 나타나 양성 반응으로 판정되지 않았다. 자극성 물질인 SLS 군(5, 10, 25%)에서 1.4, 1.2, 1.7로 나타나 양성 반응으로 판정되지 않았다. 이상의 결과 LLNA에 의한 ELISA 방법은 강한 알러젠에 대하여 검출가능하나, 약한 알러젠에 대하여는 검출하지 못하는 결과를 얻었다. 생체지표를 통한 비방사선 시험에 의한 LLNA의 지표를 탐색하기 위하여 FCM을 사용하여 접촉알러젠인 DNCB, 호흡알러젠 TDI, 약한 알러젠인 HCA, 자극제인 SLS를 Balb/c 마우스에 3일간 도포하여 LLNA시험을 실시한 후 CD3, B220, CD4, CD8을 측정하였다. T cell 지표인 CD3에 대해서는 DNCB(0.25, 0.5, 1%)군에서 93.0%, 92.6%, 87.7%로 나타나 용량의존적 감소를 보였으며, B cell지표인 B220에 대해서는 6.3%, 7.1%, 11.9%로 나타나 용량의존적 증가 경향을 나타내었다. 호흡 알러젠인 TDI(0.5, 1, 2%)군에서도 CD3에 대해서 용량 의존적 감소경향, B220에 대해서 용량의존적 증가경향을 나타내었다. 약한 알러젠인 HCA(10, 20, 30%)군에서도 CD3는 감소경향, B220은 증가경향을 나타내었다. 전군에 대해서 B/T ratio를 측정한 결과 DNCB, TDI, HCA군에 대해서 용량의존적 증가경향을 나타내었다. 그러나 강한 자극제인 SLS에서도 증가경향이 관찰되었다. Hepler T cell 지표인 CD4, Cytotoxic T cell 지표인 CD8의 변화를 관찰한 결과 CD4/CD8 ratio가 알러젠군에서 용량의존적으로 증가하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과 림프구에서의 표면항원을 이용한 LLNA 생체 지표 탐색은 비방사선법에 의한 LLNA 시험 가능성을 열어주었다. 피부미백화장품 원료인 Arbutin, Kojic acid, Azelaic acid에 대하여 LLNA를 이용하여 시험을 실시하였다. Arbutin, kojic acid, azelaic acid를 Dimethylformide(DMF)에 용해하여 Balb/c 마우스에 3일간 도포한 후, 6일째에 부검하여 이개 림프절에서의 림프구, azelaic acid 모두 림프절 중량의 유의적인 증가를 나타내지 못했다. BrdU 면역조직화학 염색결과 Arbutin 5, 10, 20%군 모두 림프절의 전체반응에서 SI가 3이상 증가되는 양성반응은 관찰되지 않았다. Kojic acid, azelaic acid역시 SI가 3이상 증가되는 양성반응은 관찰되지 않았다. 이상의 결과 20% 농도의 Arbutin, kojic acid, azelaic acid는 LLNA법에 의한 피부감작성은 나타나지 않았다.

Abstract ▼

A murine local lymph node assay (LLNA) has been developed as an alternative to guinea pig models for assessing the contact sensitization potential of chemical. However, a disadvantage of the LLNA is the need for the use of radioactive material. First, the objective of this study was to investigate t

A murine local lymph node assay (LLNA) has been developed as an alternative to guinea pig models for assessing the contact sensitization potential of chemical. However, a disadvantage of the LLNA is the need for the use of radioactive material. First, the objective of this study was to investigate the development of non-radio isotopic endopoint for LLNA using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Secondly, we aimed to investigate the potential use of a flowcytometric (FCM) method for the identification and differentiation of chemicals with the capacity to induce irritation and sensitization. Thirdly, we aimed to investigate the skin sensitization potential of skin whitening cosmetics with BrdU immunohistochemistry method by LLNA. In this study, contact allergen, dinitrochlorobenzone (DNCB), oxazolone (OXZ), respiratory allergen, toluene diisocyanate (TDI) and weak allergen, ${\alpha}$-hexylcinnamaldehyde (HCA) were used as positive chemicals and the irritant sodium lauryl sulfate(SLS) also used as a reference chemical. Female Balb/c mice were treated on the ears for 3 consecutive days with allergens or irritant. The lymph node (LN) cells were harvested 72h after the final treatment. The stimulation indices (SI) of LN cell in the mice treated with allergens, DNCB, and TDI were more increased over 3 folds compared to vehicle control by ELISA method. However, SI in OXZ and HCA were not greater than 3 folds compared to vehicle control. Mice were treated with DNCB, TBI and HCA showed a preferential increase in the percentage of B220$^{+}$ B cells compared with vehicle and irritant-treated mice. Mice were treated with DNCB, TDI and HCA showed a decrease in the percentage of CD3$^{+}$ T cells compared with vehicle and irritant-treated mice. There was a significant increase in B/T ratio of mice treated with allergen. There was an increase in CD4/CD8 ratio of mice treated with DNCB and TDI. These data suggest the possibility of use of a FCM method for the identification and differentiation of chemicals with the capacity to induce irritation and sensitization. The contact sensitizing potential of three skin whitening agents, kojic acid, arbutin, and azelaic acid were investigated using BrdU immunohistochemistry by LLNA. There were no significant changes in LN weight and cell proliferation in LN at all concentration(5%, 10%, 20%) of three whitening agents compared with vehicle control. These results show that these skin whitening agents do not have allergenic potential at even the highest concentration(20%) by LLNA.

목차 Contents

• 표지...1
• 목차...2
• 내부과제...3
• 내부과제 표지...4
• 국문요약...5
• 서론...7
• 재료 및 방법...8
• 1. 실험동물...8
• 2. 시험물질...8
• 3. 실험 방법...9
• 4. 통계처리...11
• 결과...12
• 1. ELISA를 이용한 림프절 증식 반응 측정...12
• 2. FCM을 이용한 생체 지표 탐색...17
• 3. LLNA를 이용한 피부미백화장품 원료의 피부감작성 평가...21
• 고찰...30
• 참고문헌...32
• Abstract...35