초록 ▼

본 연구는 자생식물의 성장/발생 조절유전자의 분리 및 그 기능 분석을 통하여 유용 형질전환 식물체 개발을 기본 방향으로 하고 있다. 따라서 본 연구는 (1) 기능성 유전자의 대량 분리와 기능 분석 (2) 식물호르몬 옥신과 에틸렌의 상호 작용 네트워크 기작 규명 (3) 에틸렌 신호전달 반응 규명 (4) 식물체에서의 telomerase와 telomeric repeat binding factor의 기능 분석 등 4가지의 궁극적 연구 목표를 설정하고 있다. 이러한 연구 목표를 달성하기 위해 지난 1단계 (2년 6개월) 동안의 연구에서는 (

본 연구는 자생식물의 성장/발생 조절유전자의 분리 및 그 기능 분석을 통하여 유용 형질전환 식물체 개발을 기본 방향으로 하고 있다. 따라서 본 연구는 (1) 기능성 유전자의 대량 분리와 기능 분석 (2) 식물호르몬 옥신과 에틸렌의 상호 작용 네트워크 기작 규명 (3) 에틸렌 신호전달 반응 규명 (4) 식물체에서의 telomerase와 telomeric repeat binding factor의 기능 분석 등 4가지의 궁극적 연구 목표를 설정하고 있다. 이러한 연구 목표를 달성하기 위해 지난 1단계 (2년 6개월) 동안의 연구에서는 (1) 형질전환 Arabidopsis를 이용하여 옥신에 의해 유도되는 녹두 ACC synthase 7 유전자의 promoter 분석 (2) EIN3 유전자가 과다 발현되는 형질전환 담배 제작 및 그 표현형 분석 (3) Telomerase 활성에 미치는 단백질 인산화/탈인산화 역할 규명 (4) BY-2 세포 주기 동안 telomeric repeat binding factor (NgTRFl) mRNA 발현 양상 규명과 그 세포 내 기능 규명 (5) 고추의 뿌리 발생 단계 cDNA library로부터 층 3,000개 EST 수행과 18개 뿌리 특이적 유전자의 발현 양상 규명 등 5가지 연구 과제를 수행하였다. 그 결과 auxin-responsive cis-acting element가 ACS7 promoter의 -500 nt이내에 있음을 밝혔으며 이 부분에 결합하는 핵단백질의 존재도 확인하였다. 또한, 2 종류의 녹두 full length EIN3-homolog CDNA를 분리하고 그 cDNA를 과다발현하는 형질전환 담배를 제작한 후 그 표현형을 조사한 결과 뿌리털의 비정상적인 과다 발생을 관찰하였다. 이 결과는 에틸렌이 뿌리털 형성을 촉진하는 호르몬임을 제시하고 있으며, 이 연구 결과는 현재 Plant Physiology에 투고하였다. 담배 BY-2 세포를 모델시스템으로 하는 식물 telomerase/TRF 연구는 세포분열의 5-pahse 특이적으로 나타나는 telomerase 효소활성은 protein kinase에 의해 촉진되며 반대로 protein phosphatase에 의해 억제됨을 밝혔으며 이 결과는 The Plant Journal에 2002년 3월에 발표하였다 또한 TRF mRNA의 발현 양상을 BY-2 세포의 성장 주기와 S-phase로 synchronization된 세포에서 조사한 결과 TRF 유전자의 발현이 telomerase 활성 및 세포분열과 반대되는 양상으로 나타남을 밝혔고 이 결과를 토대로 담배 NgTBP1이 telomerase 활성을 억제한다는 가능성을 제시하였다. 이 연구 결과는 J. Biol. Chem.에 accepted되어 2003년 3월에 on line으로 publish되어 있는 상태이다. 마지막으로 1차년도 연구를 통하여 제작한 고추의 early root와 early hairy root의 cDNA library에서 4,000개의 EST를 분석하였다. Reverse Northern과 Northern 분석 결과 18종류의 뿌리 발생 관련 유전자를 분리하여 그 발현 양상을 자세히 분석한 바 있다. 이상과 같이 요약한 본 과제의 1단계 연구결과는 2단계에서 진행할 예정인 보다 심층적인 연구에 중요한 기본적 지식을 제공하고 있다고 사료된다.

Abstract ▼

Telomerase is a specialized RNA-directed DNA polymerase that adds telomeric repeats onto the ends of linear eukaryotic chromosomes. It was recently reported that the low, basal level of telomerase activity markedly increased at early S phase of the cell cycle and auxin further increased the S phase-

Telomerase is a specialized RNA-directed DNA polymerase that adds telomeric repeats onto the ends of linear eukaryotic chromosomes. It was recently reported that the low, basal level of telomerase activity markedly increased at early S phase of the cell cycle and auxin further increased the S phase-specific telomerase activity in tobacco BY-2 cells. In this study, we showed that abscisic acid (ABA), a phytohormone known to induce the cyclin-dependent protein kinase inhibitor, effectively abolished both the auxin- and S phase-specific activation of telomerase in a concentration- and time-dependent fashion in synchronized tobacco BY-2 cells. These results suggestthat there exists a hormonal cross-talk between auxin and ABA for the regulation of telomerase activity during the cell cycle of tobacco cells. Treatment of synchronized BY-2 cells with the protein kinase inhibitor staurosporine or H-7 effectively prevented the S phase-specific activation of telomerase activity. By contrast, when okadaic acid or cantharidin, potent inhibitors of protein phosphatase 2A (PP2A), was applied to the cells, the S phase-specific high level of telomerase activity was continuously maintained in the process of cell cycle for at least 14 h after release from M phase arrest. Furthermore, incubation of tobacco cell extracts with exogenous PP2A rapidly abrogated the in vitro telomerase activity, while okadaic acid and cantharidin blocked the action of PP2A, thereby effectively restoring the in vitrotelomerase activity. Taken together, these findings are discussed in light of suggestion that antagonistic functions of auxin and ABA and reciprocal phosphorylation and dephosphorylation of telomerase complex are necessarily involved in the cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tobacco cells.
ETHYLENE INSENSITIVE3 (EIN3) is a transcription factor involved in the ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis. Two full-length cDNA clones, pVR-EIL1 and pVR-EIL2, encoding EIN3-LIKE proteins were isolated by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and screening the cDNA library of mung bean hypocotyls. VR-EILl and VR-EIL2 share 70% identity, and display varying degrees of sequence conservation (39-65%) with previously isolated EIN3 homologues from Arabidopsis, tobacco and tomato plants. Gel retardation assay revealed that both VR-EILs were able to interact specifically with obs1, the recently identified optimalbinding sequence for tobacco TEIL, with the binding of VR-EIL2 being more efficient than that of VR-EIL1. Transient expression analysis using a VR-EIL::smGFPfusion gene in onion epidermal cells indicated that the VR-EIL proteins were effectively targeted to thenucleus. The fusion protein of VR-EIL2 with GAL4 DNA binding domain strongly activated transcription of a reporter gene in yeast cells, and an essential domain for transcription-stimulating activity was localized to the amino-terminal acidic region that consists of 50 amino acid residues. In contrast with what has been previously found in EIN3 and TEIL-overexpressing Arabidopsis plants, transgenic tobacco seedlings expressing the VR-EIL genes under the control of CaMV 35S promoter did not exhibit a constitutive triple response. Instead, they displayed a markedly enhanced proliferation of root hairs, one of the typical ethylene response phenotypes, and increased sensitivity to exogenous ethylene. In addition, the PR genes encoding β-1,3-glucanase, osmotin and PR1 were constitutively expressed in 35S::VR-EIL lines without added ethylene and were hyper-induced in response to ethylene treatment. These results indicate that VR-EILs are functional in tobacco cells, thereby effectively transactivating the GCC-box-containing PR genes and enhancing sensitivity to ethylene. The possible physiological role of VR-EILs is discussed in the light of the suggestion that they are active components of the ethylene signaling pathway and their heterologous expressions constitutively turn on a subset of ethylene responses in tobacco plants.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...15
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...19
• 제 1절: Isolation of cDNAS differentially expressed in response to drought stress and characterization of the Ca-LEAL1 gene encoding a new family of atypical LEA-LIKE protein homologue in hot pepper ( Capsicum annuum L. cv. Pukang). (in press)...20
• 제 2절: Molecular and Biochemical Characterization of VR-EILs Encoding Mung Bean ETHYLENE INSENSITIVE3-LLKE Proteins....31
• 제 3절: Expression of the telomeric repeat binding factor gene NgTRF1 is closely Coordinated with the cell division program in tobacco BY-2 suspension culture cells....45
• 제 4절: Cell cycle-dependent regulation of telomerase activity by auxin, ABA and protein phosphorylation in tobacco BY-2 suspension culture cells....58
• 제 5절: Pathogen-induced expression of cyclo-oxygenase homologue in hot pepper...68
• 제 6절: Two polyphenol oxidases are differentially expressed during vegetative and reproductive development and in response to wounding in the Fuji apple....71
• 제 7절: IAA and N6-benzyladenine inhibit ethylene-regulated expression of ACC oxidase and ACC synthase genes in mungbean htypocotyls....79
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...88
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...90
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...90
• 제 7 장 참고문헌...91