초록 ▼

◆ 연구목적
암의 발생률과 암으로 인한 사망률은 계속 증가추세에 있으며 특히 대장암은 급격한 증가추세에 있음. 대장암은 식이성분과 밀접한 관련이 있으므로 식이성분을 조절하여 암을 예방하거나 치료하는 연구는 매우 필요함. CLA의 항암효과는 발표되었으나 CLA가 암의 발생과 전이에 관련이 깊은 세포신호전달경로 및 암의 전이에 미치는 영향에 대한 연구는 국내${\cdot}$외에서 전혀 시행되어 있지 않음. 그러므로 본 연구의 최종목적은 CLA가 대장암세포의 erbB3 신호전달경로를 억제하므로서 세포의 증식을 방

◆ 연구목적
암의 발생률과 암으로 인한 사망률은 계속 증가추세에 있으며 특히 대장암은 급격한 증가추세에 있음. 대장암은 식이성분과 밀접한 관련이 있으므로 식이성분을 조절하여 암을 예방하거나 치료하는 연구는 매우 필요함. CLA의 항암효과는 발표되었으나 CLA가 암의 발생과 전이에 관련이 깊은 세포신호전달경로 및 암의 전이에 미치는 영향에 대한 연구는 국내${\cdot}$외에서 전혀 시행되어 있지 않음. 그러므로 본 연구의 최종목적은 CLA가 대장암세포의 erbB3 신호전달경로를 억제하므로서 세포의 증식을 방해하고 apoptosis를 촉진하며, 암세포의 이동성과 전이에 영향을 미친다는 가설을 in vivo, in vitro 실험을 통하여 종합적으로 규명하는 것임. 본 실험에서는 CLA mixture와 개별 이성체들의 효능과 항암 기전을 연구하였음.
◆ 연구내용 및 방법
제 1 세부과제 : CLA와 개별 이성체들이 HT-29 대장암세포의 erbB3 신호전달경로에 미치는 영향
1) Heregulin (HRG)과 CLA와 개별 이성체들에 의한 대장암세포 증식억제와의 관계실험
2) CLA와 개별 이성체들이 erbB3 발현에 미치는 영향 실험
3) CLA와 개별 이성체들과 HRG-erbB3-PI3K signaling 관계 실험
(immunoprecipitation (IP), Western blot, $[^3H]thymidine$ iincorporation, RT-PCR, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) assay, DNA laddering, FACS analysis)
제 2 세부과제: CLA와 개별 이성체들이 암세포의 motility와 전이에 미치는 영향
1) CLA와 개별 이성체들이 대장암세포의 이동에 미치는 영향 연구
2) CLA와 개별 이성체들이 MMP 발현 및 활성에 미치는 영향 연구
3) 동물실험모델에서 CLA와 개별 이성체들이 대장암 전이에 미치는 영향 연구(Boyden chamber assay, in vivo metastasis assay, Zymography, Western blot)
◆ 연구결과 및 교찰
[제 1 세부과제]
1) HRG과 CLA와 개별 이성체들에 의한 HT-29 대장암세포 증식억제와의 관계실험본 연구의 선행연구에서 CLA가 대장암세포 증식을 농도 의존적으로 억제하였으므로 본 실험에서는 HRG가 암세포중식을 촉진하고 CLA에 의한 세포증식 억제 효과를 감소시키는지 조사하였음. HRG는 세포증식과 DNA 합섬을 촉진하고, CLA mixture는 세포증식과 DNA 합성을 억제하였음. 그러나 HRG는 CLA의 세포증식 억제와 DNA 합성 억제 효과를 감소시키지 못하였음. HHG은 사멸된 세포수를 감소시켰으나 CLA에 의해 유도된 DNA fragmentation과 세포사멸의 증가를 억제하지는 못했음. Trans-10,cis-12 CLA (t10c12)는 세포증식을 감소시켰고, HRG는 t10c12의 세포증식 감소효과를 억제하지 못하였음. 반면 같은 농도의 cis-9,trans-11 CLA (c9t11)는 세포증식에 아무런 영향을 미치지 못하였으며, HRG에 의한 세포증식을 방해하지 못하였음 T10c12는 DNA 합성을 억제하였고, HRG은 DNA 합성을 현저히 촉진시켰으나 t10c12는 HRG의 DNA 합성 촉진효과를 방지하였음. 반면 c9t11은 DNA 합성에는 영향을 미치지 않았으나 HRG의 DNA 합성 촉진 효과를 유의적으로 억제하였음. HRG만 첨가하였을 때에는 DNA fragmentation에는 영향을 가져오지 않았으나, t10c12와 HRG를 같이 첨가하였을 때에는 HHG은 t10c12에 의해 유도된 DNA fragmentation을 약간 감소시켰음. T10c12는 사멸된 세포수를 증가시켰으며 HRG은 사멸된 세포수를 감소시켰음. 반면 c9t11은 apoptosis에 영향을 미치지 않으며 HRG에 의해 유도된 apoptosis 억제에 영향을 미치지 않았음.
2) CLA와 개별 이성체들이 erbB3 발현에 미치는 영향 실험CLA mixture는 EGFR, erbB2. erbB3 단백질과 mRNA의 발현을 농도에 비례하여 유의적으로 감소시켰음. CLA mixture는 p85, HRG 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았음. T10c12는 EGFT, erbB2, erbB3 단백질 발현을 농도에 비례하여 유의적으로 억제하였으나 p85, HRG 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았음. 반면 같은 농도의 c9t11은 위의 단백질들의 발현에 영향을 미치지 않았음. T10c12는 EGFR, erbB2, erbB3 mRNA level을 농도에 비례하여 유의적으로 감소시켰으나, 같은 농도의 c9t11은 mRNA level을 감소시키지 않았음.
3) CLA와 개별 이성체들과 HRG-erbB3-PI3K signaling 관계 실험암세포에 HRG를 처리했을때 erbB로 예상되는 단백질들의 tyrosine 인산화가 증가하였고 CLA mixture에 의해 이 단백질들의 tyrosine 인산화가 억제되었음. HRG에 의한 erbB2와 erbB3의 인산화는 erbB3과 erbB2가 heterodimer를 형성하므로서 이루어진다는 것을 관찰하였음. HRG 처리 후 erbB2, 또는 erbB3 antibody로 IP 한 경우 CLA mixture에 의해 erbB2와 erbB3의 tyrosine 잔기의 인산화가 시간 의존적으로 감소되었음. T10c12를 처리한 세포에서 HRG에 의해 유도된 erbB2, erbB3 tyrosine의 인산화가 억제되었음.ErbB3과 결합하는 PI3K (p85)의 양은 HRG 처리 후 증가하였고, CLA에 의해 이 결합이 감소되었음. PI3K의 활성은 erbB3에 결합하는 p85의 양과 비례하여 변화하였고, CLA mixture에 의해 현저히 감소되었음. 활성형인 phospho-Akt 수준은 HRG에 의하여 증가하였고, CLA mixture에 의해 감소되었음, CLA mixture는 erbB3과 erbB2 단백질 수준의 변화 없이도 이 receptor들의 인산화를 감소시키고 HRG-erbB3-PI3K-Akt signaling을 감소시켰음. CLA 개별 이성체 중, t10c12 가 HRG-erbB3-PI3K-Akt의 신호전달경로를 억제하였고 c9t11은 효과가 없었음.[제 2 세부과제]1) CLA와 개별 이성체들이 대장암세포의 이동에 미치는 영향 연구Wound healing assay에서 wound를 낸 후 12시간이 되었을 때부터 세포이동성이 증가하기 시작하였고, PMA의 첨가 농도가 증가함에 따라 세포의 이동성이 증가하였음, PMA에 의해 유도된 세포 이동성은 CLA mixture 첨가시 농도가 증가함에 따라 감소하였음. CLA isomer 중에서는 c9t11을 0, 1, 2, 4 μM의 농도로 첨가하였을 때 농도가 증가함에 따라 migration이 감소되었음. 그러나 t10c12는 세포의 이동성에 영향을 미치지 않았음.Boyden chamber assay에서 SW480 cell의 이동성은 PMA의 첨가 농도가ㆍ증가할수록 증가하였고, PMA로 세포의 이동성을 유도한 후 CLA mixture를 첨가하면 농도가 증가함에 이동하는 세포의 수가 감소하였음 c9t11을 0, 1, 2, 4 μM의 농도로 첨가하였을 때 농도에 따라 유의적으로 감소하였으나 t10c12는 wound healing assay에서와 같이 세포 이동성에 영향을 미치지 않았음.2) CLA와 개별 이성체들이 MMP 발현 및 활성에 미치는 영향 연구SW480 cell에서 PMA를 첨가하치 알고 배양했을 때는 MMP의 활성이 나타나지 않았으나 PMA를 첨가하자 MMP-9의 활성이 나타났음. Immunoblotting에 의해 분자량이 92 kDa인 단백질이 MMP-9임을 확인 할 수 있었고, mRNA 발현도 관찰할 수 있었음. PMA와 함께 CLA mixture를 0, 5, 10, 20 ${\mu}M$의 농도로 첨가하였을 때, 20 ${\mu}M$에서 MMP-9의 활성이 유의적으로 감소하였으나 CLA mixture는 MMP-9의 단백질 발현과 MMP-9의 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았음.PMA와 함께 c9t11을 0, 1, 2, 4 ${\mu}M$의 농도로 첨가하였을 때 농도에 따라 MMP-9의 활성이 유의적으로 감소하였으나, t10c12를 첨가하였을 때는 MMP-9 활성에 차이를 보이지 않았음. Immunoblotting을 실행한 결과 c9t11자 t10c12 모두 MMP-9의 단백질 발현과 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았음.3) 동물실험모델에서 CLA와 개별 이성체들이 대장암 전이에 미치는 영향 연구BALB/C mice에게 CT-29 대장암세포를 주사한 생체실험에서 1％의 CLA mixture를 첨가한 식이를 먹였을 때 폐로 전이된 종양의 수가 유의적으로 감소하였고, 혈액의 MMP-9의 활성이 감소하였음. Mice에 0.1％의 수준으로 CLA isomer를 첨가한 식이를 섭취시켰을 때는 폐로 전이된 종양의 수가 감소하였고, in vitro 실험에서는 효과가 나타나지 않았던 t10c12도 암세포 전이 억제 효과를 보였음. 혈액에서의 MMP-9의 활성이 감소하였고, 특히 t10c12에서 유의적으로 감소하였음.제1세부과제와 제2세부과제의 결과들을 종합하여 보면 CLA mixture는 HRG-erbB3-PI3K-Akt의 신호전달경로를 억제하므로서 대장암세포의 apoptosis를 촉진하고 cell proliferation을 억제하며, isomer 중에서는 t10c12가 효과가 있었음. 또한 CLA mixture는 세포의 이동성과 MMP-9의 활성을 감소시킴으로 세포수준에서 암전이 과정을 억제하고 이러한 결과는 생체실험에서도 확인할 수 있었음. in vitro 실험에서는 효과가 없었던 t10c12와 효과가 있었던 c9t11 모두 생체실험에서 폐로의 전이를 억제시키는 것이 관찰되었음. 이 결과는 CLA를 암예방제 또는 전이억제제로 사용할 수 있는 증거를 제공하였음. 본 연구의 결과는 저명한 국제학술지인 Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol와 한국영양학회지에 에 출판되었고, 국내, 외 학술대회에서 12편의 논문을 발표하였음. 현재 국외 SCI학술지에 투고를 위해 논문을 준비 중임.

Abstract ▼

◆ PurposeThe incidence of colorectal cancer is increasing, and there is increasing urgency to develop strategies to prevent this disease. With regard to prevention, diet has drawn considerable attention in recent years. CLA is a mixture of positional and geometric isomers of octadecadienoic acid wit

◆ PurposeThe incidence of colorectal cancer is increasing, and there is increasing urgency to develop strategies to prevent this disease. With regard to prevention, diet has drawn considerable attention in recent years. CLA is a mixture of positional and geometric isomers of octadecadienoic acid with cis-9,trans-11 CLA (c9t11) and trans-10,cis-12 CLA (t10c12) being the principal isomers. CLA has chemoprotective properties in experimental cancer models and in vitro studies have shown that CLA inhibits HT-29 colon cancer cell growth. Members of the erbB receptor family, including epidermal growth factor receptor (EGFR), erbB2, erbB3, and erbB4 frequently contribute to the development of several human cancers. The present studies were peformed to test the hypothesis that CLA decreases cancer cell growth, motility, and metastasis and induces apoptosis by inhibiting erbB3 signaling pathway. To test this hypothesis we examined the effects of CLA and its individual isomers by utilizing the in vitro cell culture and in vivo animal model systems.
◆ Content and methods
The first sub-project: Effects of CLA and its isomers on the erbB3 signaling pathway in cancer cells
1) Effects of heregulin (HRG) on CLA (and its isomers)-induced growth inhibition of colen cancer cells
2) Effects Of CLA (and its isomers) on the expression of erbB proteins and mRNAs
3) Effect of CLA (and its isomers) on HRG-erbB3-PI3K signaling(MTT assay, $[^3H]thymidine$ incorporation, DNA laddering, FACS analysis, Western blotting, RT-PfR, immunoprecipitation, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) assay)
The second sub-project: Effects of CLA and its isomers en cancer cell motility and metastasis
1) Effects of CLA (and its isomers) on the motility of colon cancer cells
2) Effects of CLA (and its isomers) on the protein expression and activity of matrix metalloproteinase (MMP)
3) Effect of CLA (and its isomers) on colon cancer metastasis in an animal cancer model(Boyden chamber assay, in vivo metastasis assay, Zymography, Western blotting)
◆ Results and Discussion
[The first sub-project]
1) Effects of HRG on CLA (and its isomers)-induced growth inhibition of colon cancer cells
To examine CLA regulation of colon cancer cell proliferation and apoptosis, HT-29 cells were cultured in the absence or presence of CLA and/or the erbB3 ligand HRG. CLA inhibited cell growth and DNA synthesis and induced apoptosis of HT-29 cells. HRG increased cell growth but did not mitigate the effect of CLA on cell growth, DNA synthesis, or apoptosis. T10c12 inhibited cell growt and DNA synthesis and induced apoptosis of HT-29 cells, whereas c9t11 had no effect. HRG did not prevent the effect of t10c12 on cell growth of DNA synthesis.
2) Effects of CLA (and its isomers) on the expression of erbB proteins and mRNAsTo examine whether CLA influences erbB receptor expression in HT-29 cells, total cell lysates were immunoblotted with antibodies specific for EGFR, erbB2, erbB3, and erbB4. EGFR, erbB2, and erbB3 were detected in HT-39 cells, and erbB4 was not detectable under the conditions of the present experiment. CLA decreased the levels of EGFR, erbB2, erbB3 proteins and transcripts in a dose-dependent manner. T10c12 decreased the levels of EGFR, erbB2, and erbB3 proteins and transcripts in a dose-dependentnner, whereas c9t11 had not effect.
3) Effect of CLA (and its isomers) on HRG-erbB3-PI3K signalingImmunoprecipitation/Western blot stu야es revealed that CLA inhibited HRG-stimulated phosphorylation of erbB2 and erbB3, recruitment of file p85 subunit of PI3K to the erbB3 receptor, erbB3-associated PI3K activities, and phosphorylation of Akt. HT-39 cells also produced HRG, but CLA did not affect the levels of this protein. T10c12 inhibited HRG-stimulated phosphorylation of erbB2 and erbB3, recruitment of the p85 subunit of PI3L to erbB3, erbB3-associated PI3K activities, and phosphoiylation of Akt. However, c9t11 had no effect
In conclusion, we have shown that CLA inhibits cell proliferation and stimulates apoptosis in HT-29 cells, and the inhibition of HT-29 cell growth by CLA is due to the effects of t10c12. These effects of CLA may be mediated by its ability to downregulate erbB3 signaling and tile PI3K/Akt pathway.
[The second sub-project]
1) Effects of CLA (and its isomers) on the motility of colon cancer cellsTo examine if CLA reduces cell motility, the wound healing assay was performed. SW480 cells were incubated in serum-free medium with or without phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and/or CLA. The cell migration increased at 12 h after the initiation of the wound and PMA increased cell migration in a dose-dependent manner, CLA decreased the PMA-induced cell migration in a dose-dependent manner. c9t11 significantly decreased the cell migration in a dose-dependent manner, whereas t10c12 had no effect on the cell migration. Results from the Boyden chamber assay also showed that cell motility was increased by PMA and the increased cell motility due to PMA was significantly decreased by 20 ${\mu}M$ CLA in SW480 cells. C9t11 significantly decreased the cell motility in a dose-dependent manner, whereas t10c12 had no effect on the cell motility.
2) Effects of CLA (and its isomers) on the protein expression and activity of MMPGelatin Zymography and Western blot analysis revealed that PMA increased the activity and protein expression of 92,000 Mr MMP-9 in SW480 cells. CLA decreased the PMA-induced MMP-9 activity in a dose-dependent manner. However, CLA had no effect on the expression of MMP-9 proteins and transcripts. C9t11 significantly decreased the PMA-induced MMP-9 activity, whereas t10c12 had no effect. Results from immunoblotting and RT-PCR revealed that neither c9t11 nor t10c12 influenced on tile expression of MMP proteins and transcripts.
3) Effect of CLA (and its isomers) on colon cancer metastasis in an in vivo animal cancer modelResults from in vivo studies utilizing BALB/c mice revealed that the number of tumors metastasized in the lung and the activity of MMP-9 in the blood were significantly lower in animals fed a diet containing 1％ CLA mixture. Both CLA isomers (0.1％) in the diet inhibited lung metastasis of colon cancer cells and MMP activity in the blood.
In conclusion, the results from in vivo studies indicated that CLA mixture inhibited metastasis of colon cancer cells by reducing cell motility and MMP activity. Both isomers were effective in reducing the lung metastasis in BALB/c mice, even though in vitro studies showed that only c9t11 isomer was able to reduce PMA-induced MMP-9 activity. These results suggest that CLA can be used as preventive and therapeutic agents for colon cancer.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과 요약문...4
• 요약문...4
• SUMMARY...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...13
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...42
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당)...49
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...50
• 6. 연구개발결과의 파급효과...57
• 7. 첨부서류...59
• III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...105
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...106
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...107
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...110
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...122
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...127
• 6. 참고문헌...132
• IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...135
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...136
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...137
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...141
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...150
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...154
• 6. 참고문헌...158