초록 ▼

변형된 cry1Ac 유전자를 지닌 형질전환체 벼생산:Bt 본래의 내독소 단백질 유전자 cryIAc(이하 “wt-cryIAc”로 약함)는 3,537 bp로 아미노산 1,178 개를 코드하고 있다. 이 wt-cryIAc 유전자 중 앞부분 1,854 bp가 곤충 독성에 직접관련있다. 따라서 이 부분을 수정 합성함으로써 아미노산 배열은 변화시키지 않고 DNA 염기배열만 변형된 합성 곤충 독소 유전자를 만들었다. 분자생물학적인 방법으로 형질전환체(T1,T2)의 세대진전을 통한 안정적인 유전자 발현을 분석한후 생물검정을 실시하였다. 검정결과로

변형된 cry1Ac 유전자를 지닌 형질전환체 벼생산:Bt 본래의 내독소 단백질 유전자 cryIAc(이하 “wt-cryIAc”로 약함)는 3,537 bp로 아미노산 1,178 개를 코드하고 있다. 이 wt-cryIAc 유전자 중 앞부분 1,854 bp가 곤충 독성에 직접관련있다. 따라서 이 부분을 수정 합성함으로써 아미노산 배열은 변화시키지 않고 DNA 염기배열만 변형된 합성 곤충 독소 유전자를 만들었다. 분자생물학적인 방법으로 형질전환체(T1,T2)의 세대진전을 통한 안정적인 유전자 발현을 분석한후 생물검정을 실시하였다. 검정결과로는 먹노린재와 이화명나방에서 효과적이었고 특히 포장시험에서 혹명나방에대하여 현저한 방제효과를 보였다.
흡즙곤충에 대한 재조합 유전자작성 및 기작구명 : 흡즙곤충에 살충력이 있는 재조합 단백질을 만들기 위해 B.t.결정체 생산 유전자와 감자옆권바이러스(PLRV)의 피복단백질을 결합한 융합단백질을 생산하였다.
효과적인 유전자발현을위한 조직특이 프로모터개발 : 뿌리에서 선별적으로 발현하는 유전자들의 2kb upstream 부위를 binary vector에 클로닝하여 최종적으로 애기장대에서 프로모터의 활성여부에 따라 GFP나 GUS가 발현되도록 하였다.
새로운 살충성유전자 개발 : 본 과제의 1단계를 통하여 나비목 해충에 강독성인 Bt K-1 (대한민국 특허출원 제 2001-37445 호)과 Bt 2385-1 균주로부터 새로운 5종의 cry1 type의 내독소단백질 유전자를 분리하여 Genbank에 등록하였다. 또한 이들 유전자를 baculovirus expression system을 이용하여 발현하고, 이들 발현 산물의 배추좀나방 및 파밤나방에 대한 독성을 확인한 결과, 기존에 작물형질전환에 가장 널리 사용되고 있는 cry1Ac와 cry1C과 대등하거나 더 높은 독성을 나타내는 것을 확인한 바 있다.

Abstract ▼

To make insect pest resistant rice plants, we neutrally modified the DNA sequence of Bacillus thuringiensis cryIAc1 gene for better expression in rice. We analysed twelve genes from rice to get the data about the codon usage in rice. The final modified gene was different at 393 residues, 21 % of 184

To make insect pest resistant rice plants, we neutrally modified the DNA sequence of Bacillus thuringiensis cryIAc1 gene for better expression in rice. We analysed twelve genes from rice to get the data about the codon usage in rice. The final modified gene was different at 393 residues, 21 % of 1845 bases of the wild-type gene and 56 % of 615 codons. And the G+C content was increased from 37% of wild type to 48% of modified cryIAc1 gene. We synthesized DNA fragments of the modified cryIAc1 gene by recursive PCR method using 54 primers .The modified cryIAc1 gene was expressed using an insect baculovirus vector system. The product was analysed by western blot and assayed against diamondback moth larvae. The toxicity of the modified cryIAc1 protein was equivalent to wild type protein. A synthetic cry1Ac gene, codon optimized for rice, was made and linked to the rice rbcS promoter and its transit peptide sequence (Tp) for chloroplast-targeted expression. The expression of cry1Ac protein in the transgenic rice plants was determined by immunoblot analysis. cry1Ac were clearly detectable in all lines of rbcS-Tp::cry1Ac plants; whereas no expression was detected in nontransgenic plant. Stem cuttings from rbcS::Tp-cry1Ac-transformed lines were infested with the neonate larvae of Japanese black rice bug ( Scotinophra lurida) and striped stem borer ( Chilo suppressalis). Also we got the resistance of a cry1Ac - transformed rice T2 plants against natural infestations of the rice leaffolders under field condition. In fact, most of the larvae, particularly those of yellow stem borer and rice leaffolder, were found dead in the sheath tissue before they were able to penetrate into the stem. We expect fertile transgenic rice plants expressing the rbcS-Tp: :cry1Ac in chloroplasts at high levels. The use of rbcS-Tp::cry1Ac transgenic plants to express an insecticidal protein in chloroplast of transgenic rice plants would be especially useful for conferring resistance to sap-sucking insects, rice leaffolder.
The destination of CP fusion protein in the gut of aphid was investigated with fusion proteins of GFP and CP. Two different fusion protein, GFP-CP and CP-GFP were expressed using baculovirus expression vector system (BEVS). When expressed in Sf9 insect cells, fusion proteins showed a molecular weight of about 53 kDa, and CP-GFP existed as the large granular form compared to GFP-CP. To study the binding activity of GFP-CP and CP-GFP in the aphid gut, each fusion protein was mixed with aphid artificial diet and fed to adult Myzus persicae. However, none of fusion proteins were detected in the aphid when the Western
hybridization was carried out with GFP antibody against total protein of aphid fed to GFP-CP or CP-GFP fusion proteins. To determine the toxicity of Bt crystal protein against aphid and to screen crystal proteins having higher toxicity against aphids, Bt crystal proteins were fed to M. persicae in the form of non-solubilized intact form or solubilized form. The results revealed that B.t. subsp. kurstaki had relatively higher aphidicidal activity in both form used in bioassay.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• SUMMARY...10
• CONTENTS...13
• 목차...14
• 제1장 연구개발과제의 개요...14
• 제2장 국내외 기술개발 현황...20
• 제1절 국내외 연구사례...20
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과...24
• 제1절 제1세부과제: Bacillus 살충성 유전자를 이용한 해충저항성 작물개발연구(주관연구기관)...24
• 제2절 제2세부과제: 미생물로부터 딱정벌레목 살충성 유전자 개발(한림대)...87
• 제3절 제3세부과제: 곤충병원 미생물로부터 작물형질전환용 살충성 유전자 탐색(서울대)...105
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...148
• 제5장 결과의 활용계획...148
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...150
• 제7장 참고문헌...150