초록 ▼

인간을 숙주로 하는 parvovirus B19 (B19)은 혈장분획제제에 오염된 사례가 있어 혈장분획제제의 안전성 측면에서 중요하게 다루어지는 바이러스이다. Parvovirus B19는 지금까지 조사된바 거의 모든 사람 집단 내부에 상시 존재하는 endemic 형태이고, 개별적으로 연중 발생하지만, 때때로 B19 바이러스 감염은 다소 유행성 (epidemic)을 보이는 경우가 있다.
현재까지 B19을 바이러스 안전성 검증 목적으로 사용할 만큼 충분한 양으로 증식시키고 정량분석 할 수 있는 적당한 방법이 발견되고 있지 않기 때문

인간을 숙주로 하는 parvovirus B19 (B19)은 혈장분획제제에 오염된 사례가 있어 혈장분획제제의 안전성 측면에서 중요하게 다루어지는 바이러스이다. Parvovirus B19는 지금까지 조사된바 거의 모든 사람 집단 내부에 상시 존재하는 endemic 형태이고, 개별적으로 연중 발생하지만, 때때로 B19 바이러스 감염은 다소 유행성 (epidemic)을 보이는 경우가 있다.
현재까지 B19을 바이러스 안전성 검증 목적으로 사용할 만큼 충분한 양으로 증식시키고 정량분석 할 수 있는 적당한 방법이 발견되고 있지 않기 때문에, B19 clearance 검증을 위해서 모델 바이러스인 porcine parvovirus(PPV), bovine parvovirus(BPV), canine parvovirus(CPV) 등을 사용하여 왔다. PPV, BPV, CPV 등과 같은 모델 바이러스를 사용하여 clearance 검증을 실시할 때 바이러스 정량 분석은 시료를 배양세포에 접종하여 감염성 바이러스 입자의 수를 확률적으로 계산하는 세포배양법을 사용하여 오고 있다. 세포배양방법은 세포배양의 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있다.
PPV, BPV, CPV는 B19과 같은 parvovirus에 속하며 유사한 생화학적 특성을 갖고 있지만, 작은 물리·화학적 특성의 상이점이 바이러스 clearance 검증에 영향을 미칠 수 있다. 특히 바이러스 제거 공정의 검증에서는 상이한 결과를 나타낼 수 있다. 따라서 열처리, Low pH 처리, 강염기 처리 등과 같은 불활화 공정에서 바이러스 검증은 이와 같은 모델 바이러스를 이용한 검증 방법이 사용되어져야 하나, 제거 공정의 검증에서는 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 정량법이 더 정확한 결과를 나타낼 수 있다. 이를 위해 real-time PCR을 이용하여B19 DNA의 정량 분석방법을 확립하고, 확립된 분석법을 검증하여 정량분석방법을 표준화하고자 하였다. 또한 표준화된 정량분석법을 이용하여 혈장분획제제 제조공정에서 B19의 제거 효율을 검증하고 제조공정의 B19 안전성을 평가하고자 하였다. 본 연구에서는 B19 DNA 정량법을 이용한 혈장분획제제 제조공정 중 B19 제거방법의 검증 기반 확립을 위해 아래와 같은 연구를 진행하였다.
1) 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 parvovirus B19 제거 검증에 대한 관리 지침의 검토
2) 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 혈액제제 제조공정에서 parvovirus B19 제거 및 불활화 방법의 효율성 검토
3) B19 오염 혈장 선별을 위한 mini-pool PCR test 방법 확립
4) 혈장분획제제 제조공정 중 중간물질, 반제품, 완제품에서 B19 DNA 검출을 위한 PCR 확립
5) B19 제거 검증을 위해 Real-time PCR을 이용한 B19 DNA 정량법 확립
6) B19 DNA 정량법의 method validation : 확립된 검증법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감성(sensitivity), 특이성(specificity), 재현성(reproducibility), 정량한계(limit of quantitation) 등을 검증
7) B19 안전성 검증을 위한 spiking 실험법 확립
8) 혈액제제 제조공정 중 바이러스 필터 공정에 확립된 정량법을 적용하여 B19 제거 검증
9) 검증 시스템의 적합성 평가
10) 식품의약품안전청 및 제조사에 연구 성과 및 표준화 기술을 이전하기 위해 SOP를 작성

Abstract ▼

Manufacturing processes for biopharmaceutical products originated from human plasma, cell or tissues have the risk of viral contaminations. Human parvovirus B19(B19) is a frequent contaminant of such products and transmission of this virus has been shown to occur through the administration of contam

Manufacturing processes for biopharmaceutical products originated from human plasma, cell or tissues have the risk of viral contaminations. Human parvovirus B19(B19) is a frequent contaminant of such products and transmission of this virus has been shown to occur through the administration of contaminated products. B19 is a small nonenveloped virus that is known to be highly resistant to physico-chemical treatments. Owing to the lack of a suitable cultivation and/or detection system for B19, model viruses such as porcine parvovirus, bovine parvovirus, and canine parvovirus have been used for validation study of B19 clearance. Recently, quantitative real-time PCR method has been recommend for an alternative to the infectivity assay using TCID$_{50}$ or plaque forming unit. It is more reliable to use relevant B19 virus rather than model viruses when validating virus removal, because the surface characteristics of B19 may be different from those of model viruses and consequently partitioning characteristics of B19 during chromatography and virus filtration processes may be different from those of model viruses. Therefore, we have developed a quantitative real-time PCR for validation of B19 clearance during manufacture of plasma-derived products. In order to establish the validation system for B19 removal, following researches were conducted.
1) Review of regulatory guidelines for the validation of B19 removal
2) Literature review for the evaluation of B19 removal and/or inactivation methods
3) Development of mini-pool test for screening of B19 contaminated plasma
4) Development and validation of PCR assay for the detection B19 DNA from the process materials and finished products during manufacture of plasma derivatives
5) Development of a quantitative real-time PCR assay for the validation of B19 removal during manufacture of plasma derivatives
6) Method validation of the quantitative real-time PCR assay for the validation of B19 removal : sensitivity, specificity, reproducibility, and limit of quantitation were validated.
7) Establishment of B19 spiking test for the validation of B19 removal
8) Validation of B19 removal during virus filtration process for manufacturing of high purity factor IX
9) Evaluation of the validation system of B19 removal
10) Documentation of the standardization and Standard Operating Procedures (SOP)
Through this study, a quantitative real-time PCR assay for the validation of parvovirus B19 DNA removal during manufacture of plasma derivatives was developed. The validation system was successfully applied to a virus filtration process for manufacture of high-purity factor IX.

목차 Contents

• 용역연구개발사업 연구결과보고서 ...1
• 표지 ...2
• 제출문 ...4
• 연구결과보고서 요약문 ...5
• Project Summary ...6
• 목차 ...7
• 제1장 서론 ...9
• 1.1. 연구의 목적 ...9
• 1.2. 연구의 필요성 ...10
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...12
• 2.1. 생물학적 의약품의 바이러스 안정성 ...12
• 2.2. 혈장 유래 의약품의 바이러스 안정성 ...13
• 2.3. 바이러스 안정성 확보를 위한 기본적 접근 방법 ...13
• 2.4. Parvovirus B19 ...14
• 2.5. 바이러스의 제거 또는 불활화 방법 ...15
• 2.5.1. 바이러스 제거 공정 ...15
• 2.5.2. 바이러스 불활화 공정 ...16
• 2.6. 바이러스 안전성 검증의 필요성 ...17
• 2.7. 혈액제제 안전성 검증에 사용되는 바이러스 선택 ...18
• 2.8. Real-time PCR을 이용한 바이러스 제거 검증 ...19
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...21
• 3.1. 연구내용 ...21
• 3.2. 연구방법 ...22
• 3.2.1. 자료수집 ...22
• 3.2.2. 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 Parvovirus B19 제거 검증에 대한 관리 지침의 검토 ...22
• 3.2.3. 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 혈액제제 제조공정에서 Parvovirus B19제거 및 불활화 방법의 효율성 검토 ...22
• 3.2.4. B19 오염 혈장 선별 및 혈장분획제제 제조공정에서 B19 DNA 검출을 위한 PCR 확립 ...23
• 3.2.5. Real-time PCR을 이용한 Parvovirus B19 DNA 정량법 확립 ...24
• 3.2.6. B19 DNA 정량법의 method validation ...25
• 3.2.7. 정량목적의 고역가 Parvovirus B19 확보 ...26
• 3.2.8. Parvovirus B19 제거검증을 위한 spiking 실험법 확립 ...26
• 3.2.9. 혈액분획제제 제조공정에서 real-time PCR을 이용한 Parvovirus B19 제거검증 ...26
• 3.2.10. 검증 시스템의 적합성 평가 ...26
• 3.2.11. SOP를 작성하고 제조사 및 식약청에 관련 기술 이전 ...26
• 3.3. 연구결과 ...27
• 3.3.1. 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 Parvovirus B19 제거 검증에 대한 관리 지침의 검토 ...27
• 3.3.2. 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 혈액제제 제조공정에서 Parvovirus B19제거 및 불활화 방법의 효율성 검토 ...28
• 3.3.3. B19 오염 혈장 선별 및 혈장분획제제 제조공정에서 B19 DNA 검출을 위한 PCR 확립 ...29
• 3.3.4. PCR을 이용한 혈장 및 혈액제제 내 Parvovirus B19 검색 검증 ...31
• 3.3.5. Real-time PCR을 이용한 Parvovirus B19 DNA 정량법 확립 ...34
• 3.3.6. B19 DNA 정량법의 method validation ...35
• 3.3.7. 정량목적의 고역가 Parvovirus B19 확보 ...38
• 3.3.8. Parvovirus B19 제거검증을 위한 spiking 실험법 확립 ...39
• 3.3.9. 제거 검증을 위한 제조공정의 scale-down 시험법 ...39
• 3.3.10. 혈액제제 제조공정에서 real-time PCR을 이용한 Parvovirus B19 제거검증 ...42
• 3.3.11. 검증 시스템의 적합성 평가 ...42
• 3.3.12. SOP를 작성하고 제조사 및 식약청에 관련 기술 이전 ...43
• 제4장 연구개발 달성도 및 대외기여도 ...44
• 4.1. 연구개발목표 달성도 ...44
• 4.2. 대외 기여도 ...45
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...46
• 가. 계량적 성과 ...46
• 나. 성과내용기술 ...46
• 다. 활용계획 ...46
• 제6장 기타 중요변경사항 ...48
• 제7장 참고문헌 ...49
• 별첨1. 방법서 : Human parvovirus B19 유전자 검출 ...53
• 별첨2. 방법서 : Human parvovirus B19 정량분석을 위한 real-time PCR ...57
• 총괄 연구과제 요약 ...60