보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
연구책임자 |
유향숙
|
참여연구자 |
원미선
,
김동욱
,
장영주
,
정경숙
,
윤춘식
,
오현화
,
이상희
|
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2000-10 |
주관부처 |
과학기술부 |
연구관리전문기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
등록번호 |
TRKO200500064861 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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초록
▼
본 과제의 궁극적 목표는 세포성장 주기의 비정상화로 인한 정상세포에서 암세포로의 전환되는 기전 규명을 통하여 새로운 생물학적 항암제 개발로서 1) 세포주기를 조절하는 새로운 유전자 및 이의 조절인자를찾고 2) 이들의 역할을 규명하고 3) 새로운 세포주기인자 및 ras 암조절인자 유전자의 성질을 이용하여 세포성장을 조절하는 신규물질을 다량스크리닝할 수 있는 시스템 구축하고 4) 실제로 다양한 자원으로부터 스크리닝을 시도하여 신규한 세포성장조절 물질의 개발이다. 새로운 세포주기를 조절하는 새로운 유전자를 찾기 위한 핵심연구로필수 세포주
본 과제의 궁극적 목표는 세포성장 주기의 비정상화로 인한 정상세포에서 암세포로의 전환되는 기전 규명을 통하여 새로운 생물학적 항암제 개발로서 1) 세포주기를 조절하는 새로운 유전자 및 이의 조절인자를찾고 2) 이들의 역할을 규명하고 3) 새로운 세포주기인자 및 ras 암조절인자 유전자의 성질을 이용하여 세포성장을 조절하는 신규물질을 다량스크리닝할 수 있는 시스템 구축하고 4) 실제로 다양한 자원으로부터 스크리닝을 시도하여 신규한 세포성장조절 물질의 개발이다. 새로운 세포주기를 조절하는 새로운 유전자를 찾기 위한 핵심연구로필수 세포주기 인자 Pspl와 상호작용하는 Spufd2를 클로닝하였고 두 단백질이 cell cycle과 세포의 사멸에 영향을 주는 것을 밝혔다. Pspl의ubiquitin degradation 과정에 관여하는 spufd2와의 결합력이 약물 스크리닝에 사용할 수 있을 정도로 강함을 조사하였다. Pspl, 또는 mutation이 있는 PsPl*과 Spufd2와의 in vitro 와 in vivo 상호작용 정도를 조사하여 Pspl-Spufd2간의 상호작용 조절에 인산화의 중요성을 밝혔다. 세포주기 진행과 관련된 Rad24 (Gl/S), cdc25 (phosphatase), Byr2와 Ste4가 상호작용하는 성질을 이용해 물질 스크리닝 시스템 개발의 control로 동시에 적용하여 Pspl-spufd2의 상호작용을 이용한 스크리닝 시스템의 최적화를 완료하여 이들 간의 상호작용에 영향을 끼쳐 세포주기 진행을 조절할 수 있는 물질들을 찾아 낼 수 있는 효모를 이용한 간편한 스크리닝공정을 개발하였다. 또, 시료준비, 약물 처리. 효소 반응 조건을 최적화하여 대량 스크리닝이 가능한 공정 시스템 확립하였고 곰팡이 배양액과 chemical을 대상으로 상호작용을 선택적 또는 특이적으로 저해하는 약물을 스크리닝하였다. Gpa2와 상호작용하며 RAS의 기능과 연결된 7개의 transmembrane domain 가진 수용체(receptor) 유전자인 stml을 이용하여 Drug screening system을 확립하였다. 이는 이 수용체가 과다하게 발현되면 감수분열을 거치지 않고 2배체가 1배채로 전환되는 세포주기상의 의존도가줄어드는 성질을 이용한 것이다. 특히 일부 domain clone은 stml 전체보다 더 강한 효과를 가지고 있다. 또한 adenine 유전자의 point mutation을 이용한 drug처리 후의 결과탐색의 용이성이 이 screening system의 장점이다. 본 연구의 수용체 stml과 그의 domain clone을 이용한 drug screeing system은 세포주기와 세포신호전달 기전규명에 유용한 방법이며, 이 성질을 이용하여 과도한 세포주기 진행에 의한 세포성장을 억제하는 물질 탐색과 ras와 관련된 항암제 탐색에 이용될 수 있다.
Abstract
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The cell division cycle, which proceeds to G1, S (DNA replication), G2, and M (Mitosis) phase in all eukaryotic cells, is controlled tightly to keep the normall cellular growth and differentiation. The loss of this control causes abnormal cellular growth and may leads to transformation into cancerou
The cell division cycle, which proceeds to G1, S (DNA replication), G2, and M (Mitosis) phase in all eukaryotic cells, is controlled tightly to keep the normall cellular growth and differentiation. The loss of this control causes abnormal cellular growth and may leads to transformation into cancerous cellular growth. Several elements such as cdc2/$p^{34}$ and cyclins which control the cell cycle progression specifically at each phase of the cellcycle have been identified, and mechanisms of these controls have begun to be elucidated. It is known that all eukaryotic cells use similar mechanisms for this regulations.In an attempt to isolate new cell cycle regulatory elements and to study cell cycle control mechanisms in relation to oncogenic process of the cells, we used the genetically well defined fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, which is evolutionally closer tomammalian cells. In the first and second phase of research, the new cell cycle regulatory elements Pspl and Stml were cloned and characterized by both genetic and molecular biological methods such as complementation of cell cycle progression defective mutants, homology sequence analysis, differential hybridization and syntheticlethality screening. The goal of the last two-year research is to establish drug screening system using those two proteins to find new leads in the anti-cancer drug development. The results of last two-year research are as follows.1. Pspl(=Sds23) suppresses a mutation in a gene essential for Gl/S and G2/M transition in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Pspl is phosphorylated by several kinases including Cdc2/cyclinB, protein kinase A and stress-activated MAP kinase Styl. Phsophorylation of Pspl by these kinases upon entry into G0-likestationary phase of cells is essential for S, pombe cells to maintain cel1 survivability under this stressed condition. Pspl also interacts with Dis2 phosphatase and Spfd2, a novel ubiquitin fusion degradation protein homolog. Depending on its role during cell cycle transition, the phsophorylated form of Pspl seems to be either degraded by ubiquitin-mediated degradation system through Ufd2 or dephosphorylated to enter into the active mitotic cell cycle. These kinases and type-1 phosphatase regulate the functions of Pspl in the mitotic cell cycle at different level, and multi-phosphorylation of Pspl is important for inhibiting ongoing cell cycle and driving S.pombe cells to enter into G0-1ike dormant state and maintaining cell viability at this stage. At the same time, Phosphorylation of Pspl might be also important for proper destruction of Pspl through ubiquitin-fusion degradation proteins when necessary.2. Since Pspl interacted strongly with Spufd2 in the two-hybrid assay which Pka, Styl, Cdc2 and Dis2 were also tested forinteraction with Pspl, drug screening of yeast two-hybrid assay involving Pspl and Spufd2 was designed. In addition to Pspl-Spufd2, Ste4-Byr2, Cdc25-Rad24 were exploited to increase specificity and remove false positives in screening. This system emphasized simple methods for sample preparation, drug treatment, enzyme assay to develop HTS system. The target drug in this system is cell cycle regulator which causes the direct inhibition of interaction between Pspl and Spufd2 or indirect interference of interaction by inhibition of phosphorylation or other mechanism.We screened chemical library and extracts prepared from various fungi, plant and Actinomycetes. Several known and unknown drugs demonstrated the specific inhibition of interaction between Pspi and Spufd2. They belong to kinase inhibitor, angiogenesis inhibitor or anti-cancer drug. This result clearly proved that interaction of Pspl and Spufd2 plays important role in cells and the drugs inhibiting this interaction causes serious defects in cell cycle. This drug screening system can be developed to HTS to discover new lead compound to regulate cell proliferation and apoptosis.3. A putative seven transmembrane protein gene, $stml^{+}$, required for recognition of nutritional deficiency signal in initiating sexual differentiation of S, pombe, was isolated as a multicopy suppressor of rasl synthetic lethal mutant. Stml interacts withheterotrimeric G protein, Gpa2, that modulates cAMP level and stml ̄gap2 ̄ mutant showed faci1itated meiotic differentiation even in nutritionally rich condition. When Stml is overexpressed, diploid cells coverted to haploid cells resulted in pink colonieis, which is due to ade marker of cells. We exploited this "red colony assay" and developed screening system for the drug which transduces signals to regulate cell differentiation. Domain analysis of Stml by yeast two hybrid and in vitro binding experiments indicates that the C-terminal 90 amino acids including transmembrane 5-7 domains is necessary for interaction with Gpa2. Using specific domain of Stml, the clear and fast screening of drug is feasible. We can search for new lead compound that inhibits cell growth caused by excess cell division or ras-related anti-cancer drug.
목차 Contents
제 1 장 서 론...22
제 2 장 국내외 기술개발 현황...27
제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...31 제 1절 실험재료...31 1. 균 주...31
2. 배 지...31
3. Oligonucleotide합성 및 PCR (polym erase chain reaction)...32
4. Reagents...32
5. Radiochem icals...33
6. 현미경 및 flow cytom eter...33
7. 제한효소...33
8. Filter...33
9. Sequencing...34
10. UV crosslinker...34
11. Electrophorator...34
제 2 절 실험방법...35 1. S. pom be transform ation...35
2. Isolation of plasm id from S. pom be trnasform ants...35
3. Library com plem entation을 이용한 ts- m utant의 phenotype...36
4. E. coli tranform ation...37
5. Flow cytom etric analysis...38
6. Gene disruption...38
7. M em brane과 cytosolic phase의 분리...41
8. Im m unochem ical analysis...41
9. Psp1과 상호 작용하는 인자 Spufd2 유전자의 분리...42
10. S. pom be에서 psp1와 Spufd2 유전자의 발현...42
11. Psp1의 인산화가 Spufd2과의 in vitro 상호작용...44
12. 효모 tw o- hybrid assay을 이용한 Psp1과 Spufd2의 상호작용...44
13. 상호작용하는 세포성장 조절인자들의 클로닝...45
14. tw o- hybrid vector에 클로닝 및 이스트 형질 전환...45
15. yeast tw o- hybrid assay를 이용한 단백질 상호작용 확인...46
16. 효모 tw o- hybrid assay를 이용한 약물 스크리닝...46
17. Stm 1의 overexpression...47
18. stm 의 Tw o hybrid assay...47
19. Stm 1의 과발현에 의한 2배체 분열효모 SP286의 1배체로의 전환유도 및 색깔에 의한 관찰...48
20. Stm 1의 dom ain clone 만들기...49
21. Stm 1과 Gpa2의 in vitro binding assay...50
22. stm 1- I clone을 이용한 drug screening...50
제 3 절 결과 및 고찰...52 제 1 항...52 1. Psp1과 상호작용하는 Spufd2의 유전자 분리...52
2. Psp1의 기능을 조절하는 인자 Cdc2, Pka1, Sty1 kinase, Dis2 발견...53
3. Psp1과 결합하는 kinase, phosphatase, ubiquition fusion degradation protein과의 결합력 측정...53
4. Psp1의 인산화가 cell의 Survival에 미치는 영향...53
5. Psp1의 인산화와 Spufd2과의 in vivo와 in vitro 상호작용...54
제 2 항...56 1. 약물 스크리닝 조건의 최적화 및 공정완료...56
2. Psp1과 상호작용하는 spufd2의 결합을 이용한 약물 스크리닝...56
3. Spufd2와 상호작용하는 세포성장 조절인자들의 탐색...57
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