초록 ▼

ELISA 테스트 등과 같은 혈액의 항원 항체 진단법으로는 혈액 및 혈액제제에서 B형 간염바이러스(HBV), C형 간염바이러스(HCV), 및 에이즈바이러스(HIV-1) 등이 감염된 사실을 완전히 진단하기가 어렵다는 것이 알려져 왔다. 그러므로 가능한 한 적은량의 바이러스 감염까지도 탐지하려고 핵산증폭테스트(NAT) 방법이 도입되어 안전한 수혈체계와 혈액제제를 사용하도록 하는데 근거를 제공하고 있다. 그리하여 이러한 NAT 테스트 방법을 적용하는데 있어서 복잡성과 고비용 등의 문제에도 불구하고 전체 헌혈 혈액을 모두 테스트하여 안전한

ELISA 테스트 등과 같은 혈액의 항원 항체 진단법으로는 혈액 및 혈액제제에서 B형 간염바이러스(HBV), C형 간염바이러스(HCV), 및 에이즈바이러스(HIV-1) 등이 감염된 사실을 완전히 진단하기가 어렵다는 것이 알려져 왔다. 그러므로 가능한 한 적은량의 바이러스 감염까지도 탐지하려고 핵산증폭테스트(NAT) 방법이 도입되어 안전한 수혈체계와 혈액제제를 사용하도록 하는데 근거를 제공하고 있다. 그리하여 이러한 NAT 테스트 방법을 적용하는데 있어서 복잡성과 고비용 등의 문제에도 불구하고 전체 헌혈 혈액을 모두 테스트하여 안전한 혈액이 수급되도록 노력하고 있다.
본 연구과제에서는 비용이 적게 들고 용이하게 바이러스 감염 또는 오염을 탐지할 수 있는 다중핵산증폭(Multiplex PCR) 방법을 세워 HBV, HCV, 및 HIV-1 바이러스들을 시료에서 동시에 탐지할 수 있도록 하는 혈청 및 혈액제제 시료의 스크리닝 시스템을 개발하려고 하였다.
추출된 RNA 바이러스 유전물질을 Nested-PCR을 실시한 후 DNA 바이러스 유전물질과 혼합하여 한 개의 시험관에서 Multiplex-PCR 하여 증폭된 PCR 산물의 크기가 각각 바이러스에 따라 다르게 하여 특유한 바이러스의 존재를 탐지하고 식별할 수 있도록 하였다. 이를 위해 서로 다른 바이러스에 특이적인 primer 지표를 사용하여 한 개의 테스트 튜브에서 한 번에 각 바이러스를 특이적으로 식별 가능한 DNA 조각으로 만들어지도록 하여 실험실에서 손쉽게 아가로즈 젤 전기영동으로 내재된 바이러스 종류를 식별케 하였다. 이들 지표 primer들 간에는 유사한 염기서열이 없도록 디자인되었으며, 시료에 들어 있는 한 가지 바이러스가 있을 경우 서로 간섭되지 않도록 하였다.
Agarose gel 상에서의 탐지할 수 있는 감도가 자동화된 시스템에서 보다 낮게 나오는 단점이 있지만, 이를 동위원소 표지법 등으로 활용할 경우, 한 번의 실험에서 세 가지 서로 다른 위해 바이리스를 탐지할 수 있는 시스템으로 활용할 수 있을 것이다.

Abstract ▼

It has been known that the complete detection of viral infections by HBV, HCV, and HIV-1 viruses into blood and blood related-products according to the serological screening methods of antigen-antibody reaction such as ELISA tests is not easy. Therefore, nucleic acid amplification testing methods(NA

It has been known that the complete detection of viral infections by HBV, HCV, and HIV-1 viruses into blood and blood related-products according to the serological screening methods of antigen-antibody reaction such as ELISA tests is not easy. Therefore, nucleic acid amplification testing methods(NAT) adopted to detect the small quantitative viral nucleic acids could be supported the basis of using and supplying the blood and its related products safely. Although there are some problems such as high prices and complexities in the application of NAT system, more stable supplies of blood is being proceeded to the whole blood tests.
This research work is basically designed to describe the simultaneous blood screening system by Multiplex or Duplex tests for detecting infections or contamiantion with HBV, HCV, and HIV-1 viruses in the blood sera at one time with low price and labor. It is aimed at easy detection by using the conventional agarose gel electrophoresis. Thus, we tried to detect and identify the virus in the blood sample according to their different size of PCR products. We set it up with consensus conditions to recognize each viral DNA fragments after running the Multiplex PCR in one tube. This is done by nested RT-PCR using two different RNA viral genomic templates followed by multiplex PCR with the addition of viral DNA and their primers after purifying the viral genomic nucleic acids. Those specific primer markers can be used without any interference to amplify each viral genome in the blood samples.
The sensitivities of detection with different viral loads were so low due to the detecting PCR products on the agarose gel electrophoresis and its observations with naked eyes. If we could label these PCR products with specific radioactive isotope or dyes, three different viral agents could be assayed and screened with higher sensitivities.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서...1
• 표지...2
• 제출문 ...4
• 목차 ...6
• I. 연구결과보고서 요약문...8
• (한글)...8
• (영문)...9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...10
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...10
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...10
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...11
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...14
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...16
• 2.1 연구개발내용...16
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...20
• 1. Dual PCR 증폭시 최적 Annealing temperature...20
• 2. Control Plasmid DNA에 의한 Detection Limitation 확인...21
• 3. Validation of Reproducible PCR Methods...24
• 4. 각 PCR Primer에 대한 음성혈청에서의 각 바이러스 특이도 검사...27
• 5. 음성 혈청으로 판정된 시료에 대한 특이도(Specificity) 검사...29
• 6. HBV, HCV, 및 HIV-1 바이러스 양성 혈청검체에 대한 단일 PCR 검사...30
• 7. HBV, HCV, 및 HIV-1 바이러스의 각각 양성 혈청검체에 대한 Multiplex-PCR검사...31
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...36
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...40
• 5.1 활용성과...40
• 5.2 활용계획...41
• 제6장 기타 중요 변경사항...42
• 제7장 참고문헌...44
• 제8장 첨부서류...48
• 총괄 연구과제 요약...49