초록 ▼

이 연구의 목적은 세 가지 동물 실험(안점막 자극시험, 피부 감작성 시험, 피부 자극성 시험)에 대해 대체시험법을 마련하고 validation study를 시행하기 위한 것이다. 독성 평가를 위해 많은 실험동물이 사용되고 있는데, 3R의 원칙을 고려한다면 믿을만한 대체시험법을 확립하는 것이 무엇보다도 중요하다.
안점막 자극시험의 대체시험법으로 HET-CAM 또는 bovine corneal opacity assay가 잘 알려져 있고, 특히 유럽 국가에서는 화장품 등을 검사하기 위해 시행된다. 국내에서도 몇몇 화장품 회사에서 HE

이 연구의 목적은 세 가지 동물 실험(안점막 자극시험, 피부 감작성 시험, 피부 자극성 시험)에 대해 대체시험법을 마련하고 validation study를 시행하기 위한 것이다. 독성 평가를 위해 많은 실험동물이 사용되고 있는데, 3R의 원칙을 고려한다면 믿을만한 대체시험법을 확립하는 것이 무엇보다도 중요하다.
안점막 자극시험의 대체시험법으로 HET-CAM 또는 bovine corneal opacity assay가 잘 알려져 있고, 특히 유럽 국가에서는 화장품 등을 검사하기 위해 시행된다. 국내에서도 몇몇 화장품 회사에서 HET-CAM을 이미 시행하고 있다. 그래서 이번 연구에서는 HET-CAM의 standard ooperating procedure(SOP)를 설정하고 intra-laboratory validation을 시행하였다. Bovine corneal opacity 역시 유럽 국가에서는 자주 사용되고 있으나 국내에서는 opacitometer가 없었다. 이번 연구에서 BCO assay를 시행하고, neutral red uptake assay를 bettary test로 사용하였다. 이 두 시험법은 draize test와 매우 높은 상관성(상관계수 > 0.9)을 나타내어서, validation study가 좀 더 이루어진 후에는 안점막 자극 시험의 대체시험법으로 확립될 수 있을 것이다.
또한 피부감작성물질과 단순자극성물질을 구분할 수 있는 in vitro 대체시험법을 개발하고 표준화하였다. 실험동물을 이용한 시험에서 감작성물질로 분류된 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB), hexyl cinnamic aldehyde (HCA), eugenol, hydroquinone과 자극성물질로 분류된 methyl salicylate (MS), sodium lauryl sulfate (SLS), benzalkonium chloride (BC), dimethyl sulfoxide (DMSO)를 개발 시험법에 적용하여 시험법의 대체시험법으로서 효용성을 평가하였다. THP-1 monocytic leukemia cell의 세포배양시 생성되는 macrophage inflammatory protein 생성수준이 피부감작성물질에서는 시험물질이 첨가되지 않은 대조 실험의 경우에 비해 유의하게 항진된 반면 단순자극성물질에서는 대조실험의 경우와 차이가 없었다.
또한 THP-1 cell에서 분화 marker인 CD54와 CD86이 변화를 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB), hexyl cinnamic cobalt sulfate heptahydrate (Co), aldehyde (HCA), eugenol과 자극성물질로 분류된 sodium lauryl sulfate, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 대하여 평가하였다. 항원에 대한 이들 지표의 발현 정도가 만족할 만한 수준은 아니지만, 어느 정도 비 항원성 물질과 구별됨을 확인하였다. 이 결과는 본 시험법의 대체시험법으로서 사용 가능성을 제고하는 것이라고 할 수 있다.
마지막으로, 이번 시험에서는 피부자극 대체시험에 대한 새로운 모델을 모색하고자 하였다. 인공 피부 모델은 EPI-200과 keraSkin을 이용하였다. 이들에 대해 세포생존율과 il-1alpha의 분비량을 측정하여 Speerman's rank correlation analysis로 in vivo와 in vitro 사이의 상관성을 분석하였다. 그 결과 상관계수가 세포 생존율은 Epiderm 모델에서 KeraSkin 모델에 비해 높게 산출되었고, IL-1a의 경우 KeraSkin 모델에서 Epiderm 모델에 비해 높게 산출되었다.
이상의 결과로 KeraSkin 모델을 피부자극에 대한 대체법에 적용 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

The objective of this study is the validation of several alternative methods to three animal experiments(Draize eye irritation test, skin sensitizing test, and skin irritation test). Toxicological studies of many chemicals in laboratory animals had been developed until these days. However, in consid

The objective of this study is the validation of several alternative methods to three animal experiments(Draize eye irritation test, skin sensitizing test, and skin irritation test). Toxicological studies of many chemicals in laboratory animals had been developed until these days. However, in considerating the 3Rs(reduction, refinement, and replacement) of animal experimentation, it is very important to establish the reliable alternatives to animal test.
Alternative methods to the Draize eye irritation test, such as the hen's egg test-chorioallantoic membrane(HET-CAM) or the bovine corneal opacity assay, are currently used to evaluate the irritant potential of cosmetic or consumer products in many EU countries. HAT-CAM test is already peformed in Korea, some cosmetic companies. So we made the SOP(Standard Operating Procedure) of HET-CAM test and did intra-laboratory validation study. Bovine corneal opacity assay and neutral red uptake assay are also used in another countries, but there was no apparatus measuring whole-mounted corneal opacity in Korea. So we performed the BCO assay as an alternative test to draize test, and the neutral red uptake(NRU) assay as a battery system. They are correlated well with draize test(Pearson's correlation coefficiency>0.9). After more validation studies have done, they will be a good alternative methods to draize test.
We developed a in vitro assay to classify chemicals into contact sensitizers or irritants. Chemicals used were 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, hexyl cinnamic aldehyde, eugenol, hydroquinone as sensltizers, and methyl salicylate, sodium lauryl sulfate, benzalkonium chloride, dimethyl sulfoxide as irritants based on animal results. Level of macrophage inflammatory protein (MIP-1beta) produced from THP-1 monocytic leukemia cells was significantly enhanced in the presence of the sensitizers, but the irritants could not significantly modulate the level of MIP-1 beta compared with the level of MIP-1beta without the chemicals. This assay could be considered a valuable alternative tool for screening chemicals for their sensitizing potential. Sensitizer such as 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, hexylcinnamic aldehyde, cobalt sulfate enhanced CD54 and/or CD86 expression on THP-1 cells, while eugenol and non-allergen sodium lauryl sulfate and dimethyl sulfoxide did not augment CD54 and/or CD86 expression. These results suggest that these test systems have a possibility to predict contact-sensitizing ability of chemicals as in vitro sensitization assay.
Lastly, we tried to find the new model about alternative skin irritation test. We measured cell viability and IL-1alpha release using EpiDerm and KeraSkin as in vitro model. For the analysis of the correlation between in vivo and in vitro, with the Spearman`s rank correlation analysis. Thus, the coefficient of correlation of cell viability for EpidDerm model was higher than Keraskin model and the coefficient of correlation of IL-1alpha release for KeraSkin model was higher than EpidDerm model. Therefore we suggest that the alternative test using KeraSkin model would be applicable instead of skin irritation test.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서...1
• 제출문...12
• 목차...13
• I. 연구개발결과 요약문...15
• 연구결과보고서 요약문...15
• Summary...16
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...18
• 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...18
• 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...19
• 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...22
• 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...33
• 제 5 장 총괄연구개발과제의 연구성과...37
• 제 6 장 기타 중요변경사항...38
• 제 7 장 참고문헌...39
• III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...41
• 제 1 장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...42
• 제 2 장 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...44
• 제 3 장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...49
• 제 4 장 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...63
• 제 5 장 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...69
• 제 6 장 참고문헌...70
• IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...73
• 제 1 장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...74
• 제 2 장 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...81
• 제 3 장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...86
• 제 4 장 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...105
• 제 5 장 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...110
• 제 6 장 기타 중요변경사항...111
• 제 7 장 참고문헌...112
• V. 제 3 세부연구개발과제 연구결과...116
• 제 1 장 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...117
• 제 2 장 제 3 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...119
• 제 3 장 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...124
• 제 4 장 제 3 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...130
• 제 5 장 제 3 세부연구개발과제의 연구성과...131
• 제 6 장 기타 중요변경사항...132
• 제 7 장 참고문헌...133