보고서 정보
주관연구기관 |
식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation |
연구책임자 |
윤혜성
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참여연구자 |
김광진
,
안준익
,
이정선
,
방서영
,
강남희
,
김지영
,
김학
,
전혜련
,
조아랑
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2020-12 |
과제시작연도 |
2020 |
주관부처 |
식품의약품안전처 Ministry of Food and Drug Safety |
등록번호 |
TRKO202100007695 |
과제고유번호 |
1475011790 |
사업명 |
안전성평가기술개발연구(R&D) |
DB 구축일자 |
2021-07-31
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키워드 |
안자극시험법.통합독성평가.동물대체시험법.단계적 접근법.Eye irritation.IATA.Alternative test method.Tiered approach.
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초록
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유럽연합에서 처음으로 화장품 및 제품에 대한 동물실험 금지법이 통과되어 현재는 국제적으로 화장품 또는 원료에 대하여 동물 실험을 금지하고 있는 추세이다. 이러한 추세에 맞추어 안자극을 평가하는 동물실험(in vivo Draize rabbit eye test)을 대체하기 위한 여러 대체시험법들이 개발되고 있지만, 단일 동물대체시험법을 이용하여 생체 시스템을 완전히 대체하기에는 아직까지 어려운 실정이다. 그래서 OECD에서는 QSAR, in chemico, in vitro, ex vivo, in vivo 시험 등을 통합한 결과를 이용하
유럽연합에서 처음으로 화장품 및 제품에 대한 동물실험 금지법이 통과되어 현재는 국제적으로 화장품 또는 원료에 대하여 동물 실험을 금지하고 있는 추세이다. 이러한 추세에 맞추어 안자극을 평가하는 동물실험(in vivo Draize rabbit eye test)을 대체하기 위한 여러 대체시험법들이 개발되고 있지만, 단일 동물대체시험법을 이용하여 생체 시스템을 완전히 대체하기에는 아직까지 어려운 실정이다. 그래서 OECD에서는 QSAR, in chemico, in vitro, ex vivo, in vivo 시험 등을 통합한 결과를 이용하여 안자극을 평가하는 통합독성평가(IATA)를 제시하고 있다. 이에 따라 통합독성평가의 일부분으로 여러 대체시험법들과 기존 문헌 결과 등을 이용한 단계적 접근법을 통해 안자극 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 안자극 평가에 활용되기에는 어렵다. 따라서 본 연구에서는 안자극 평가에 적합한 통합독성평가 단계적 접근법을 마련하기 위해 OECD 안자극 시험 가이드라인의 개정된 내용을 반영하여 대체시험법을 최적화하고, 아직 공식적으로 검증되지 않은 시험법에 대하여 국내 적용을 위한 표준화 방법을 마련한 후 여러 안자극 대체시험법 실험 수행을 통해 도출된 각 시험법의 결과를 단계적 접근법 전략(안)에 적용하여 예측력 분석을 통해 타당성을 확인하고자 하였다.
먼저, STE 시험법 최적화와 HET-CAM 시험법 표준화를 하고자 하였다. STE 시험법(OECD TG 491)은 시험물질의 MTT 반응성이 결과에 영향을 미칠 것으로 예상되는 경우 MTT assay를 대신할 수 있는 다른 세포독성시험으로 평가하라는 내용이 추가되었다. 이에 따라 본 연구는 후보 세포독성시험으로 ATP, Resazurin, Protease, Neutral red assay를 선정하여 MTT assay를 이용한 실험 결과와 비슷한 결과를 가지는 세포독성시험법을 찾기 위해 OECD TG 491의 숙련도물질(11종)을 이용하였고, 문헌조사를 통해 선정한 MTT 반응성을 나타낸다고 알려진 물질 82종 중 STE 시험법에서 MTT 반응성을 보인 물질(5종)에 대하여 시험하였다. 그 결과, 숙련도 물질에서는 Neutral red assay가 MTT assay 결과와 일치하였지만 MTT 반응성을 나타내는 물질에서는 in vivo UN GHS 분류 기준과 비교시 MTT assay가 가장 일치하였다. 따라서 STE 시험법에서 시험물질이 MTT 반응성을 나타낼 가능성은 적으며, MTT 반응성을 보이더라도 안자극 분류에 있어 MTT assay가 가장 적합하다는 것을 확인하였다. HET-CAM 시험법은 아직 공식적으로 검증되지 않은 시험법으로 국내 적용을 목표로 표준화하기 위하여 문헌 조사를 하였으며, 문헌마다 다르게 제시되어 있는 방법은 실험을 통해 정하였고, 표준화 방법(안)을 마련하였다.
그리고 표준화 방법(안)이 타당한지를 확인하기 위하여 시험물질 18종에 대해 시험기관 간 비교한 결과, Cat. 1 물질은 두 기관 간 상당수가 일치하였으나, Cat. 2, No Cat. 물질은 불일치하는 것을 확인하였다. 이후 HET-CAM 시험법의 한계점 보완을 위해 표준화 방법(안)을 수정하였고 불일치했던 물질 14종에 대하여 시험기관 간 재시험을 수행하였다.
그 결과, 14종 중 9종이 일치하여 실험실 간 재현성이 높아진 것을 확인하였으며 추가적으로 HET-CAM 시험법 참고자료로 ATLAS를 마련하였다.
위의 실험을 통해 시험법 확립을 한 후 문헌조사를 통해 5가지 안자극 동물대체시험법(STE, HET-CAM, BCOP, EpiOcular™, MCTT)을 선정하였으며, Draize eye test Reference Database를 이용하여 시험물질 75종(1차연도: 30종, 2차연도: 45종)을 선정하였다. 그리고 각 물질의 5가지 시험법에 대한 문헌을 조사하여 기존 데이터가 없거나 기존 데이터 간 결과가 불일치한 물질에 대하여 5가지 시험법을 수행하였다. 이후 각 시험법 장점 및 한계점을 고려하여 전략(안)을 구상하기 위해 순서도를 마련하였고, 각 시험법을 순서도에 적용하여 전략(안) 1∼9를 구상하였다. 그리고 75종 시험물질에 대한 각 시험법들의 실험 결과를 전략(안) 1∼9에 적용하여 예측력을 분석하였다. 그 결과, 82.7%~88.0%의 정확도, 88.9%~97.8%의 민감도, 73.3%~83.3%의 특이도를 나타냈으며, RhCE 시험(EpiOcularTM, MCTT HCETM) 중 MCTT HCETM 시험법을 적용한 전략(안)이 더 예측력이 높은 것으로 나타났다. 위의 결과를 바탕으로 정확도가 88%로 가장 높았던 전략(안) 1과 8을 안자극을 평가하기 위한 단계적 접근법으로 제시하고자 한다.
이외 추가적으로 OECD 안자극 시험가이드라인이 ‘18년~‘20년에 개정되어 화장품 안자극 동물대체시험법 가이드라인을 개정하였고, 2017년에 제정된 OECD 안자극 통합독성평가지침 GD 263의 일부로 안자극 통합독성평가의 요소에 대한 지침을 마련하였다.
(출처 : 요약문 4p)
Abstract
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Since the European Union passed the bill prohibiting animal testing on cosmetics and ingredients, there has been a growing global trend to ban cosmetics test on animals. In keeping with the trend, a number of alternative test methods have been developed to replace animal test (in vivo Draize rabbit
Since the European Union passed the bill prohibiting animal testing on cosmetics and ingredients, there has been a growing global trend to ban cosmetics test on animals. In keeping with the trend, a number of alternative test methods have been developed to replace animal test (in vivo Draize rabbit eye test) that evaluates eye irritation. However, complete replacement of the biological system of an animal with a stand-alone alternative method still remains a challenge. Therefore, the OECD has suggested an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) which evaluates eye irritation by utilizing integrated results from QSAR, in chemico, in vitro, ex vivo, in vivo tests, etc. For this reason, as a part of the IATA, different studies on eye irritation evaluation using several alternative test methods and the test results of the existing literatures are under way. However, there is a limitation to use them for eye irritation evaluation. Therefore, this study aimed to establish a draft of tiered approach/strategy in IATA suitable for evaluating eye irritation. To that end, alternative test method was optimized by reflecting the revision in OECD Test Guideline and test methods that had not been officially validated were standardized for domestic application. Then, the validity of the tiered approach/strategy was confirmed by applying each test result that was generated by conducting a number of alternative test methods on eye irritation and analyzing it. First of all, the study aimed to optimize the Short Time Exposure (STE) test and standardize the Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) test. The updated OECD TG 491 on the STE test suggests that when MTT reactivity of the test material is expected to interfere with the test results, another cytotoxicity assay replacing MTT assay should be used. Therefore, we selected candidates of alternative cytotoxicity assays such as the ATP, Resazurin, Protease, and Neutral red assays and tested the 11 proficiency substances of TG 491 to find a cytotoxicity assay which shows similar results with the MTT assay. Also, we tested 5 chemicals that showed MTT interference with the STE test among 82 chemicals known to show MTT interference by literature survey. As a result, neutral red assay and MTT assay produced consistent results on proficiency substances while the results of the MTT assay on the materials that have MTT reactivity were the most consistent with the in vivo UN GHS Category. Test substances are less likely to show MTT interference in the STE test and we confirmed the MTT assay was most suitable for classifying eye irritation although the test chemicals showed MTT interference. To standardize the HET-CAM test, which is not yet an officially validated test method, with the goal of domestic use, we investigated literatures and test methods which were described differently in each literature were selected via conducting HET-CAM test. We then came up with a draft of standardized method for the HET-CAM test. Also, two laboratories conducted tests using 18 chemicals to confirm the validity of the draft. The results demonstrated that prediction results of Cat. 1 chemicals were mostly consistent between laboratories while those of Cat. 2 and No Cat. chemicals are mostly inconsistent. After that, we revised a draft of standardized method and performed re-test between laboratories on 15 test chemicals which were inconsistent between laboratories to supplement limitations on the HET-CAM test. As a result, we confirmed that reproducibility between laboratories increased as results on 9 test chemicals among 14 test chemicals were consistent between laboratories. Additionally, we prepared ATLAS as a reference material of the HET-CAM test. After establishment of test method according to the above tests, 5 alternative test methods on eye irritation (STE, HET-CAM, Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method (EpiOcularTM; MCTT HCETM) were selected based on our literature review and 75 chemicals (first year: 30 chemicals, second year: 45 chemicals) were selected using the Draize eye test Reference Database. In addition, the 5 test methods were performed on some of the 75 chemicals when there were no existing data or whose test results were inconsistent with existing data. After that, flow charts were designed to devise drafts of tiered approach/strategy in consideration of strengths and limitations of each test method and draft 1~9 of tiered approach strategy were formed by applying each test to the flow charts. Also, predictive capacities of the draft 1~9 of tiered approach/strategy were analyzed by applying each test result of 75 test chemicals. As a result, the drafts of tiered approach/strategy showed an accuracy of 82.7%~88.0%, a sensitivity of 88.9%~97.8%, and a specificity of 73.3%~83.3%. Also, the predictivities of the drafts of tiered approach/strategy with MCTT HCETM test were higher than those of the drafts of tiered approach/strategy with EpiOcularTM test. Based on the above results, the draft 1 and 8 of tiered approach/strategy which showed the highest accuracy were suggested as the tiered approach strategy for evaluating eye irritation. Additionally, three alternative test guidelines on evaluation of eye irritation for cosmetic were revised along with revisions of the OECD Test Guidelines on eye irritation in 2018~2020. Also, a guidance describing the elements of the IATA for serious eye damage and eye irritation as part of the OECD Guidance document No. 263 was created.
(출처 : Summary 5p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
- 요 약 문 ... 4
- Summary ... 5
- 목차 ... 6
- Ⅰ. 연구개발과제 연구결과 ... 7
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
- 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 9
- 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 16
- 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 189
- 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련 분야 기여도 ... 195
- 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 196
- 제7장 참고문헌 ... 197
- 제8장 첨부서류 ... 205
- 끝페이지 ... 206
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