보고서 정보
주관연구기관 |
동국대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
이애영
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참여연구자 |
김난형
,
김지영
,
이현주
,
전송희
,
정경희
,
김소윤
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2006-11 |
과제시작연도 |
2006 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO200700007565 |
과제고유번호 |
1470001505 |
사업명 |
의약품안전연구개발 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
세포치료제.평가항목과 방법.적정계대.적정세포수.인간헤르페스바이러스.유전자변이.cell therapy.assessment items and methods.proper passage.proper cell number.mycoplasma.human herpes virus.renetic polymorphism.
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초록
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연구 목표: 세포치료제 허가를 위한 비임상독성 시험평가법을 확립하는 것이 목표이므로 어떠한 상태의 배양세포를 치료제로 이용할 수 있는가에 대한 조건을 제시하여야 함. 따라서 대상 세포를 배양조건 하에서 상태를 확인하고 이를 동물에 이식하여 안전성과 효능을 비교하는 것이 필요함. 본 연구는 대상이 되는 세포로 피부를 구성하는 섬유아세포와 멜라닌세포로 하였음.
연구 내용: 평가항목의 선정은 미국 FDA의 <세포치료 및 유전자 치료에 관한 규정>을 참고로 선정하였고 문헌고찰을 통하여 평가항목을 위한 평가방법을 선정하여 시행하였음.
연구 목표: 세포치료제 허가를 위한 비임상독성 시험평가법을 확립하는 것이 목표이므로 어떠한 상태의 배양세포를 치료제로 이용할 수 있는가에 대한 조건을 제시하여야 함. 따라서 대상 세포를 배양조건 하에서 상태를 확인하고 이를 동물에 이식하여 안전성과 효능을 비교하는 것이 필요함. 본 연구는 대상이 되는 세포로 피부를 구성하는 섬유아세포와 멜라닌세포로 하였음.
연구 내용: 평가항목의 선정은 미국 FDA의 <세포치료 및 유전자 치료에 관한 규정>을 참고로 선정하였고 문헌고찰을 통하여 평가항목을 위한 평가방법을 선정하여 시행하였음. 선정한 평가항목에 대한 배양과 동물이식에서의 결과를 비교하고 배양한 세포를 판매하는 연구소의 규정 등을 참고로 초기에 선정하였던 평가항목을 보완하고 적절한 평가방법을 선정하였음.
연구 항법 :
1) 평가항목으로는 세포독성, 생물학적 오염, 세포의 동질성 유무 및 유전자 변이와 오염을 조사함.
2) 각 항목의 평가방법으로 배양한 세포독성은 MTT assay, cell cycle analysis, Ki67 면역형광검사, TUNEL assay, caspase로의 면역블롯 등을 이용함. 동물에 이식한 경우는 세포수와 계대에 따른 독성을 조사하되, TUNEL assay와 Ki67 조직면역검사, 이식 부위의 염증반응의 임상 및 조직학적 검사, 다른 장기로의 세포 전이나 염증반응 유발 등에 대한 여러 장기의 조직검사를 시행함.
3) 배양세포의 생물학적 오염으로 초기에는 세균, 효모균, 진균 외에 mycoplasma에 대한 검사로 한정함.
4) 배양세포의 동질성 유무와 유전자변이는 finger printing과 comet assay를 주로 사용하고 있어 이 방법을 이용함. 동물에 이식한 경우도 유전자변이를 comet assay로 시행함.
연구 결과:
1) 배양세포 모두에서 계대가 낮을수록 세포 수가 많을수록 성장이 증가하나 동물에 이식시 일정 수 이상의 세포가 있어야 효과가 나타나므로 각 세포마다 적정한 세포 수 범위를 규정하는 것이 필요함. 염증반응 등의 독성은 세포수나 계대에 무관함.
2) 생물학적 오염에서 mycoplasma의 경우 배양세포의 성장둔화와 세포모양 변화를 관찰할 수 있고 동물이식 후 mycoplasma는 조직에서 소실되나 세포성장은 정상세포와의 달리 둔화됨.
이들 연구 결과를 근거로 평가항목과 방법을 보완 제시하였음.
3) 유전자변이는 배양세포의 계대가 높아질수록 즉, 세포가 늙으면 가능성 증가하므로 비록 동물이식후 6주 이내에서는 암의 발생을 확인하지 못하였으나 결과의 데이터베이스화를 통하여 허용 계대 규정을 고려.
4) 평가항목은 원래 선정한 항목으로 가능하다 판단함 다만 같은 시간대에 한가지 세포만 배양하고 피펫 등을 1회용으로 사용하는 조건 하에서 세포독성은 문제가 되지 않으므로 세포 질에 대한 관리를 고려.
5) 평가방법으로 세포독성은 배양세포의 경우 MTT와 TUNEL assay로, 동물에 이식후는 TUNEL assay와 Ki67 면역형광검사가 적절. 생물학적 오염은 가능한 범위를 확대하여 결과의 데이터베이스화가 바람직. Mycoplasma의 경우 PCR 이외에 직접 배양을 권하고 있으나 PCR로도 균주의 규명이 가능하여 향후 비교를 통하여 방법을 규정. 동질성 유무와 유전자변이는 microsatellite 방법으로 동시에 조사가 가능함.
Abstract
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Study Purpose: This study requires to propose which condition of cultured cells would be appropriated for the cell therapy. For establishment of preclinical toxicity assessment items and methods for autogenic or allogenic cell therapy, it was planed to confirm the cell status at the certain culture
Study Purpose: This study requires to propose which condition of cultured cells would be appropriated for the cell therapy. For establishment of preclinical toxicity assessment items and methods for autogenic or allogenic cell therapy, it was planed to confirm the cell status at the certain culture conditions and to compare the safety and effectiveness of cell therapy in the animals which were transplanted the in vitro confirmed cells. Here, skin fibroblasts and melanocytes were used.
Study Methods: The items were selected on the basis of from FDA and the methods were on published articles. The items and methods were revised under the reference of the results from in vitro and animal studies, and a regulation from Cascade Biologics in USA, which is a research center of preparing cells for sale.
1)As the assessment items, cytotoxicity, biological contamination, cellular homogeneity, and genetic contamination/polymorphism were examined.
2) As assessment methods for each item, MTT assay, cell cycle analysis, Ki67 immunofluorescence, TUNEL assay, western blot with caspases were applied for study of cytotoxicity. In case of animal study, tocixity was examined according to number and passage of cultured cells. TUNEL assay, Ki67 immunohistochemistry, clinical and pathological imflammatory reactions, cell transfer to remote organs with/without inflammation were examined using biopsied organs 3)including skin, liver, spleen, lung, kidney, and lymph node.
Biological contamination of cultured cells were examined for bacteria, yeast, fungi, and mycoplasma at the beginning of this study.
4) For cellular homogeneity and genetic contamination/polymorphism, finger printing and comet assay were planed at the beginning. In animal study, comet assay was used.
Study Results:
1) The lower passage or higher cell number, the more remarkable cellular growth. However, there were effective cell number for cellular transplantation to animal. Proper range of cell number might be defined for the cell therapy. Inflammatory reactions were not related to the cell number or passage number.
2) The contamination of mycoplasma resulted in morphological change with retarded growth of cultured cells. Mycoplasma finally disappeared after transplantation of the contaminated cells to animal, but growth of the cells was retarded.
3) Genetic polymorphism proned to develop in higher passages of cell culture. Although development of cancer was not detected in this study, it required to be longterm study with defining proper range of passage number for cell therapy.
4) The above items seemed to be reliable for the assessment. Whenever single kind of cell were cultured in certain time period using disposable pipets or other equipments, many likings concerned about, including cytotoxicity did not occur, Quality control of cultured cells may be more important than examination of cytotoxicity.
5) For the methods, cytotoxicity of cultured cells could be assessed by MTT and TUNEL assay, whereas that of tissue specimens by an immunohistochemistry with Ki67 and TUNEL assay for apoptosis detection. In the biological contamination, HIV type 1, hepatitis B/C was recommended, besides bacteria, yeasts, fungi and mycoplasma. Human herpes viruses have not been recommended to examine, however, they are involving in the increasing number of diseases. Both direct culture and PCR were recommended for detection of mycoplasma infection, but proper methods should be determined from application of these two methods to many cases. Both cellular homogeneity and genetic polymorphism could be assessed simultaneously by a microsatellite method.
The original assessment items and methods were revised on the basis of these study results.
목차 Contents
- 표지 ...1
- 용역연구사업 연구결과보고서 ...2
- 제출문 ...3
- 목차 ...4
- I. 연구결과보고서 요약문 ...5
- (한글) ...5
- (영문) ...6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...7
- 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
- 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...16
- 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...21
- 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...30
- 제 5 장 총괄연구개발과제의 연구성과...33
- 제 6 장 기타 중요변경사항 ...35
- 제 7 장 참고문헌 ...37
- 제 8 장 첨부서류 ...41
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