보고서 정보
주관연구기관 |
동국대학교 DongGuk University |
연구책임자 |
최원상
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2007-06 |
과제시작연도 |
2006 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO200700009995 |
과제고유번호 |
1470001704 |
사업명 |
독성연구개발 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
식품.노로바이러스.검출법.Norovirus.detection method.food.
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초록
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본 연구과제의 목표는 식품으로부터 노로바이러스를 검출할 수 있는 시험법을 개발하는 것이다. 엽채류인 상추, 깻잎, 양배추와 과실류 중 딸기, 복분자, 포도를 대상으로 하였다.
제1세부과제
본 과제는 채소류 중 엽채류에 오염된 바이러스를 검출하는 시험 방법을 확립하는 것으로 양배추, 상추, 깻잎을 대상으로 하였다. 노로바이러스는 배양된 세포에서 증식을 하지 않아 plaque assay 가 불가하므로 단계별 점검이 가능하지 않고 마지막 단계까지 진행된 후에만 최종확인이 가능하므로 중간단계 점검이 가능한 폴리오바이러스를 이용하
본 연구과제의 목표는 식품으로부터 노로바이러스를 검출할 수 있는 시험법을 개발하는 것이다. 엽채류인 상추, 깻잎, 양배추와 과실류 중 딸기, 복분자, 포도를 대상으로 하였다.
제1세부과제
본 과제는 채소류 중 엽채류에 오염된 바이러스를 검출하는 시험 방법을 확립하는 것으로 양배추, 상추, 깻잎을 대상으로 하였다. 노로바이러스는 배양된 세포에서 증식을 하지 않아 plaque assay 가 불가하므로 단계별 점검이 가능하지 않고 마지막 단계까지 진행된 후에만 최종확인이 가능하므로 중간단계 점검이 가능한 폴리오바이러스를 이용하여 각 단계별 효율을 비교하였다. 확립된 검출 방법은 추출 완충용액을 이용한 추출, polyethylene glycol(PEG)을 이용한 농축, chloroform을 이용한 불순물제거, PEG를 이용한 2차 침전, TRIzol을 이용한 RNA추출, isopropanol을 이용한 RNA 침전 그리고 추출된 RNA를 이용한 RT-PCR을 포함한다. 각 채소에 폴리오바이러스를 인위적으로 오염시킨 후 18가지 추출완충용액으로 추출한 후 plaque assay 를 이용하여 추출효율을 비교하였다. 비교해 본 완충용액 중 양배추와 상추의 경우는 0.25M threonine/0.3M NaCl pH 9.5가 가장 효과적으로 건조시킨 야채의 표면으로부터 바이러스를 추출할 수 있었고 깻잎의 경우는 0.25M glycine/0.3M NaCl pH 7.5가 가장 효과적이었다. 추출된 바이러스의 비율은 초기 감염수준을 기준으로 양배추의 경우 평균 90.0%, 상추는 평균 62.5%, 깻잎은 52.1%였다. 추출된 바이러스를 농축하고 불순물을 제거하기 위해 PEG 8000 또는 10000으로 농축하고 chloroform을 처리한 결과 추출된 바이러스 중 양배추는 평균 41.7%, 상추는 평균 33.9%, 깻잎은 평균 27.2% 회수되었고 다시 한번 더 PEG침전을 행할 경우 양배추는 32.2%, 상추는 21.9%, 깻잎은 24.4% 회수할 수 있었다. 이 방법을 노로바이러스에 적용해 본 결과 양배추의 경우 25 g 당 250 RT-PCR unit, 상추와 깻잎의 경우 10g 당 500 RT-PCR unit 까지 검출이 가능하였다.
제2세부과제
포도나 딸기와 같은 과실류에서 노로바이러스의 검출방법은 과실류에 의한 식중독의 방지나 역학조사에 필수적인 기술적인 요소이다. 그러니 현재까지 과실류에서의 노로바이러스 검출의 최적화나 효율은 종합적으로 연구가 수행되지 않아서 과실류에 의한 식중독의 방지나 역학조사에 많은 어려움이 존재하였다. 본 연구과제에서 과실류에 오염된 노로바이러스의 추출 및 분석방법의 최적화를 수행하였다. 과실류에 존재하는 노로바이러스를 분석하기 위해서는 바이러스의 추출(elution), 농축(concentration), 핵산 추출(nucleic acid extraction) 및 유전자 증폭실험(nucleic acid amplificaiton)의 다단계를 거치며, 본 연구과제에서는 각 단계의 최적조건을 다양한 조건에서 비교 분석하였다. 먼저 포도와 딸기에서 바이러스 추출을 가장 효과적으로 할 수 있는 조건을 잡는 것을 수행하였다. 본 연구과제에서 사용된 추출용액은 증류수, 3% beef extract(pH=7.1), 0.05M Glycine+0.14 NaCl(pH=7.5), 2.9% tryptose phosphate broth+6% glycine, 100 mM Tris-HCl(pH=9.5), 50 mM Glycine+50 mM MgCl2(pH=9.5) 등이 사용되었으며 포도에서는 50 mM Glycine+50 mM MgCl2(pH=9.5)를 제외한 대부분의 버퍼가 딸기에서는 3% beef extract가 추출효율이 가장 좋았다. 일반적으로 많이 사용되는 PEG 농축을 최적화하기 위하여 다양한 분자량의 PEG와 농축시간(4시간 vs. overnight)을 비교분석하였다. 그 결과 포도에서는 3% beef extract인 경우는 PEG의 분자량에 관계없이 효율이 높았으며 그리고 딸기류에서??으로 노로바이러스 핵산추출 및 증폭방법으로 열처리, QIAamp viral RNA mini kit, TOYOBO magextractor, Trizol 용액, 그리고 immunomagnetic separation(IMS) 등의 5가지의 방법을 비교 분석하였으며 이중에서 포도의 경우에는 QIAamp viral RNA kit이 효율과 민감도에서 가장 좋게 나왔다.
Abstract
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Part 1. Development of norovirus detection method from vegetables
A viral elution-concentration procedure was developed for the detection of norovirus contaminated vegetables by RT-PCR. The procedure included elution with buffer, polyethylene glycol(PEG) precipitation, chloroform extraction, 2nd
Part 1. Development of norovirus detection method from vegetables
A viral elution-concentration procedure was developed for the detection of norovirus contaminated vegetables by RT-PCR. The procedure included elution with buffer, polyethylene glycol(PEG) precipitation, chloroform extraction, 2nd PEG precipitation, viral RNA extraction with TRIzol, isopropanol precipitation and RT-PCR. Poliovirus type 1 Sabin strain was used to evaluate the efficacy of the virus recovery. Eighteen buffers were compared for virus elution and 0.25M threonine/0.3M NaCl pH 9.5(for cabbage and lettuce) and 0.25M glycine/0.3M NaCl pH 7.5(for sesame leaf) were selected. Virus mean recovery was 90.0% for cabbage, 62.5% for lettuce and 52.1% for sesame leaf. After the PEG precipitation and chloroform treatment, 41.7% of the eluted poliovirus was recovered from cabbage, 33.9% was recovered from lettuce and 27.2% was from sesame leaf. Second PEG precipitation recovered 32.2%(cabbage), 21.9%(lettuce) and 24.4%(sesame leaf) of the eluted poliovirus respectively. We applied this procedure to norovirus. It is estimated that the possible detection limits of this method were 250 RT-PCR unit per 25 g cabbage and 500 RT-PCR unit per 10 g lettuce or sesame leaf.
Part 2. Development of norovirus detection method from fruits
Norovirus(NoV) is known as the single most cause of outbreaks as well as sporadic cases of acute gastroenteritis in children and adults. The detection methods of NoV from various fruits such as grapes, strawberry, and raspberry are important for preventing and investigating foodborne outbreaks through fruits contaminated with NoV. This research project investigated and optimized the detection method of NoV on fruits. We characterized three critical steps for NoV detection that are elution, concentration, and nucleic acid extraction methods. Tested elution buffers are 3% beef extract(pH=7.1), 0.05M Glycine with 0.14 NaCl(pH=7.5), 2.9% tryptose phosphate broth+6% glycine, 100 mM Tris-HCl(pH=9.5), and 50 mM Glycine with 50 mM MgCl2(pH=9.5). All buffers except 50 mM Glycine with 50 mM MgCl2 efficiently eluted NoV from grapes, and 3% beef extract had the highest efficieny of elution from strawberry. We also compared the efficiency of polyethylene glycol(PEG) precipitation in different conditions including molecular weight of PEG, and precipitation time. In our experiment. precipitation with PEG10,000 in 3% beef extract for 4 hours had the highest recovery efficiency for both strawberry and raspberry. For grape, the molecular weight of PEG was not critical, and precipitation of NoV in 3% beef extract for 4 hours has the highest recovery efficiency. Finally, we compared five different viral nucleic acid extraction methods such as heat release. QIA viral RNA minikit. TOYOBO magnetic beads, trizol and immunomagnetic separation(IMS). Among these methods, QIA viral RNA minikit and TOYOBO showed the highest recovery efficiency for grapes and strawberry, respectively. Our optimized detection method could be useful implements for diagnostic test of NoV contaminated fruits.
목차 Contents
- 용역연구개발사업 연구결과보고서 ...1
- 연구과제제안서(RFP) ...2
- 제출문 ...3
- 목차 ...4
- I. 연구개발결과 요약문 ...5
- 한글 요약문 ...5
- 영문 요약문 ...6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...7
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...7
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...9
- 1.3 국내?외 기술개발 현황 ...9
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...12
- 제1세부과제 ...12
- 제2세부과제 ...14
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...20
- 제1세부과제 ...20
- 제2세부과제 ...25
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...46
- 제1세부과제 ...46
- 제2세부과제 ...47
- 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...51
- 5.1 활용성과 ...51
- 5.2 활용계획 ...52
- 제6장 기타 중요변경사항 ...53
- 제7장 참고문헌 ...54
- 제8장 첨부서류 ...60
- III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ...61
- 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...62
- 1.1 세부연구개발과제의 목표 ...62
- 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ...64
- 1.3 국내·외 기술개발 현황 ...64
- 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...66
- 1. 연구내용 ...66
- 2. 연구방법 ...66
- 제3장. 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...68
- 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...73
- 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...74
- 5.1 활용성과 ...74
- 5.2 활용계획 ...75
- 제6장 기타 중요변경사항 ...76
- 제7장 참고문헌 ...77
- 제8장 첨부서류 ...81
- IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...82
- 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...83
- 가. 연구의 목적 및 필요성 ...83
- 제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...85
- 1. 연구내용 ...85
- 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...91
- 가. 추출용액 (elution buffer)의 선정 ...91
- 나. Polyethylene glycol precipitation (PEG 침전)의 최적화 조건 ...95
- 다. 바이러스 핵산추출방법 (viral nucleic acid extraction) ...102
- 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...113
- 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...117
- 5.1 활용성과 ...117
- 5.2 활용계획 ...118
- 제6장 기타 중요변경사항 ...119
- 제7장 참고문헌 ...120
- 총괄 연구과제 요약 ...123
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