보고서 정보
주관연구기관 |
동국대학교 DongGuk University |
연구책임자 |
최원상
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2004-11 |
과제시작연도 |
2004 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO201000016395 |
과제고유번호 |
1470000874 |
사업명 |
식품의약품안전성관리 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
식중독 바이러스.detection of foodborne virus.
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초록
▼
1. 연구의 최종목표
굴로부터 노로바이러스의 존재 여부를 신속히 확인할 수 있는 분석방법의 확립
1) 굴을 모델 식품으로 하여 이로부터 노로바이러스 RNA를 효과적으로 추출 및 정제하는 방법 확립.
2) 노로바이러스를 효과적으로 농축하는 방법의 확립
3) 한국에 분포된 노로바이러스 유전자 정보를 분석하여 노로바이러스 검출을 위한 primer 개발
2. 연구내용 및 결과
제1세부과제
1)굴로부터 폴리오바이러스의 검출 방법을 확립하였다. 확립된 방법을 이용하여 굴에 존재하는 RT-PCR 방해물질의
1. 연구의 최종목표
굴로부터 노로바이러스의 존재 여부를 신속히 확인할 수 있는 분석방법의 확립
1) 굴을 모델 식품으로 하여 이로부터 노로바이러스 RNA를 효과적으로 추출 및 정제하는 방법 확립.
2) 노로바이러스를 효과적으로 농축하는 방법의 확립
3) 한국에 분포된 노로바이러스 유전자 정보를 분석하여 노로바이러스 검출을 위한 primer 개발
2. 연구내용 및 결과
제1세부과제
1)굴로부터 폴리오바이러스의 검출 방법을 확립하였다. 확립된 방법을 이용하여 굴에 존재하는 RT-PCR 방해물질의 제거실험을 행한 결과 Viral gene spin과 SV total RNA isolation system은 효과가 있었으나 시료를 20배 희석하여도 비슷한 수준의 효과를 볼 수 있었다.
2)굴로부터 노로바이러스의 검출 방법을 확립하였다. 확립된 방법을 기본으로 이용하되 추출용매로는 프레온대신 chloroform으로 대체가 가능하였고, PEG를 1회 처리한 것과 2회 처리한 결과는 본 연구에 사용된 조건하에서는 노로바이러스 검출에 차이가 없었다. 또한 굴 전체를 사용하는 것과 소화기만을 사용하는 경우 노로바이러스의 검출한계에 차이가 없었다. 결론적으로 굴로부터 노로바이러스를 신속히 검출하기 위한 바이러스 RNA 추출 및 정제 방법을 확립하였으며 확립된 검출방법은 기존의 방법에 비해 단지 몇 단계의 처리만으로도 보다 효율적으로 굴 추출물에 오염된 노로바이러스를 검출하는 것을 가능하게 하므로 장차 노로바이러스의 검출에 적용 가능할 것으로 사료된다.
제2세부과제
제2세부과제에서는 굴에서 바이러스 입자를 분리하여 농축하는 단계를 개선하여 보다 효율적인 검출방법을 도출하였다. 노로 바이러스에 대한 surrogate 균주로서 같은 Caliciviridae 과에 속하고 CRFK 세포주에서 배양이 가능한 Feline Cacicivirus를 사용하였다. 초고속원심분리법 대신 용매추출법과 PEG 침전법에 기본을 둔 검출방법을 개발하였다. 굴 시료 25g을 175mL의 PBS용액에 넣어 직접 마쇄하는 방법을 이용함으로서 실험의 간편성과 표준성을 제고하였다. RT-PCR 효율을 떨어뜨리지 않으면서 산흡착 단계를 생략할 수 있었다. 무엇보다도 핵심적인 것은 overnight 단계가 필요하던 PEG 침전단계를, PEG 농도를 높이고 튜브를 마쇄 얼음에 방치함으로서 3시간으로 단축한 것이다.
제3세부과제
1) 국내에 발생한 집단발병의 분자역학적 정보를 얻기 위하여 1999-2004까지 국내에서 확인된 노로바이러스 총 158개 (RNA dependent RNA polymerase 57, capsid 부위 101개)를 분석하였다. RNA dependent RNA polymerase 부위를 분석한 결과 genogroup I에서는 3형이, genogroup II에서는 4형이 주요한 아형으로 나타났다. 특히 2002년 유럽에서 집단 발병의 주요 아형으로 밝혀진 genogroup II의 4형 변이체가 국내 2사례에서 확인되었다. capsid 부위의 분석결과 genogroup I에서는 1, 3(39.4%), 4(27.3%), 6형이, genogroup II에서는 1, 2, 3(17.6%), 4(38.2%), 5, 6, 8형이 주요한 아형으로 나타났다.
2) 국내 strain에 기초하여 capsid 부위를 검출할 수 있는 primer set A와 primer set B를 제작하였으며 primer set A가 genogroup I 과 II에 대한 특이도에 있어 primer set B보다 뛰어났지만 비특이적 밴드는 오히려 primer set B에서 감소하는 양상을 보였다. 민감도에 있어서는 primer set A가 2ng/ul까지만 검출한 반면 primer set B는 0.2ng/ul까지 검출하여 더 높은 민감도를 보였다.
3) 193개의 임상검체를 대상으로 새로 제작한 primer sets의 효율성을 평가한 결과 primer set A는 135개를 검출하여 70%의 검출률을 보였으며 primer set B는 76개를 검출하여 39.3%의 검출률을 보였다. 그러나 primer set B의 genogroup I primer인 경우 primer set A가 검출하지 못하는 검체를 21개(10.9%)나 추가로 검출하여 한국형 genogroup I strains에 대한 높은 특이성을 보였다. 따라서 genogroups의 검출을 위해서는 primer set A와 primer set B를 함께 사용하는 것이 노로바이러스 검출에 유용할 것이다.
Abstract
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1. Aim of the study
Establishment of rapid detection method for the norovirus in oyster
1) establishment of norovirus RNA extraction and purification method from norovirus-contaminated oyster
2) establishment of norovirus concentration method in oyster (calicivirus as a model)
3) develop
1. Aim of the study
Establishment of rapid detection method for the norovirus in oyster
1) establishment of norovirus RNA extraction and purification method from norovirus-contaminated oyster
2) establishment of norovirus concentration method in oyster (calicivirus as a model)
3) development of primers for the detection of Korean type norovirus based on norovirus sequence
2. Contents and Results
part 1.
1) A rapid detection method of poliovirus (as a model) in oyster was established. From the norovirus-contaminated oyster, poliovirus was easily detected. Viral gene spin (Intron) or SV total RNA isolation system (Promega) were effective for the removal of RT-PCR inhibitors. However, QIAshredderTM Homogenizer (QUIGEN) was not effective for the removal of PCR inhibitors.
2) A rapid detection method of norovirus in oyster was established. Chloroform worked well for the extraction of noroviral RNA as a substitute for Freon. In the method developed, the second PEG treatment could be omitted for more rapid detection. Comparison of norovirus detection in whole oyster extract and dissected oyster extract (digestive organs) showed no difference in detection limit. In conclusion, we developed the method for the rapid isolation and purification method of noroviral RNA in oyster, and the method will be useful for the rapid detection of norovirus in oyster.
part 2.
This study evaluated and modified major steps of virus particle separation and concentration from contaminated oyster. As a surrogate model for NoroVirus, we used Feline Calicivirus that belongs to the same Caliciviridae Family and is culturable in CRFK cell line. Instead of ultracentrifugation method, an efficient method based on solvent extraction and PEG precipitation procedure was developed. Direct homogenization of 25g sample of whole oyster in 175mL PBS provided simplicity and standardization. Acid adsorption step was eliminated without dropping RT-PCR detection level. Most significantly, the overnight PEG precipitation step could reduced to 3 h by putting the tube on ice and increasing PEG concentration.
part 3.
We performed the analysis of nucleotide sequences of norovirus strains (1999-2004). Nucleotide sequences of the capsid(n=101) or RNA-dependent-RNA polymerase(n=57) region of 158 norovirus strains were analyzed.
1.The most predominant strains of genogroups I and II were genotype 3 and genotype 4, respectively. Especially, the new genogroup II 4 variant that caused the majority of outbreaks in Europe in 2002 was also identified in two cases. From the analysis of the capsid region, the predominant strains of genogroups I and II were subtypes 1, 3, 4, and 6 and subtypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 8, respectively. The Phylogenetic analysis showed that subtypes 3 and 4 of genogroups I and II were predominant strains during 1999-2004.
2.We designed two primer sets, A and B, based on the sequence analysis. The specificity of two primer sets were tested. PCR products of primer set A were obtained as band at 325bp and 310bp, respectively. PCR products were obtained as a clear band at 258bp and 264bp generated by primer set B. To test the sensitivity of two primer sets, viral RNA genome was diluted for detecting GI and GII by primer set A and B. The positive results of the highest dilution in primer set A were 2ng/ul for GI and GII. whereas those of primer set B were 0.2ng/ul for GI and GII.
3.We applied two primer sets to 193 stool samples and evaluated the detection efficiency. Primer set A was capable of amplifying 135(70%) out of 193 samples, 66(34.2%) for GI, 69(35.8%) for GII. In contrast, primer set B amplified 76(39.3%) out of 193 samples, 57(29.5%) for GI, 19(9.8%) for GII. Although primer set B showed lower detection rate than primer set A, 21(10.9%) samples were amplified by primer set B only.
목차 Contents
- I. 연구결과보고서 요약문...1
- (한글) 식품중 식중독 바이러스 검출법 개발 연구...1
- (영문) Development of protocol for the detection of foodborne virus in food...2
- 목차...3
- II. 총괄연구과제 연구결과...4
- 제1장 서론...4
- 제1절 연구개발의 목적...4
- 제2절 연구개발의 필요성...4
- 제3절 연구개발의 범위...5
- 제2장 국내외 기술개발 현황...6
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...7
- 제1절 제1세부과제...7
- 제2절 제2세부과제...8
- 제3절 제3세부과제...9
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...10
- 제1절 연구개발목표의 달성도...10
- 제2절 대외기여도...11
- 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...12
- 제6장 기타 중요변경사항...13
- 제7장 참고문헌...14
- III. 제1세부과제 연구결과...16
- 제1장 서론...18
- 제2장 국내외 기술개발 현황...19
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...20
- 제1절 연구 재료 및 방법...20
- 제2절 제1세부과제의 연구개발 결과...21
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...29
- 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...30
- 제6장 기타 중요변경사항...31
- 제7장 참고문헌...32
- IV. 제2세부과제 연구결과...37
- 제1장 서론...39
- 제2장 국내외 기술개발 현황...41
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...42
- 제1절 연구 내용 및 방법...42
- 제2절 연구결과...45
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...52
- 제1절 연구개발목표 및 평가의 착안점...52
- 제2절 대외기여도...52
- 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...53
- 제6장 기타 중요변경사항...54
- 제7장 참고문헌...55
- V. 제3세부과제 연구결과...62
- 제1장 서론...64
- 제1절 세부연구개발의 필요성...64
- 제2절 연구개발의 목표 및 범위...64
- 제2장 국내외 기술개발 현황...65
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...66
- 제1절 연구대상...66
- 제2절 연구방법...66
- 제3절 연구결과...68
- 제4절 연구결과 고찰 및 결론...78
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...80
- 제1절 목표달성도...80
- 제2절 대외기여도...80
- 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...81
- 제1절 계량적 성과...81
- 제2절 성과내용기술...81
- 제3절 활용계획...81
- 제6장 기타 중요변경사항...82
- 제7장 참고문헌...83
- 세부 연구과제 요약...85
- 총괄 연구과제 요약...88
- 연구결과보고서...91
- 표지...92
- 제출문...94
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