초록 ▼

▶ 의약용 백신으로 사용될 수 있는 VLP 단백질을 고농도로 생산하기 위해서 최신의 유전공학, 단백질공학, 유전체학, 대사공학, 발효공학 등을 기반으로 효모의 유전체를 조절하여 최적화된 재조합 S. cereuisiae 시스템 구축 및 효율적인 VLP 생산공정을 개발하였음.
▶ 구체적으로 자궁경부암 유발 바이러스인 HPV의 surface antigen 유전자 2종을 확보하였고 효모발현시스템을 구축하였으며 재조합 효모를 이용한 HPV 발현확인 및 western blotting을 이용한 HPV 분석방법을 확립하였음.
▶ Hep

▶ 의약용 백신으로 사용될 수 있는 VLP 단백질을 고농도로 생산하기 위해서 최신의 유전공학, 단백질공학, 유전체학, 대사공학, 발효공학 등을 기반으로 효모의 유전체를 조절하여 최적화된 재조합 S. cereuisiae 시스템 구축 및 효율적인 VLP 생산공정을 개발하였음.
▶ 구체적으로 자궁경부암 유발 바이러스인 HPV의 surface antigen 유전자 2종을 확보하였고 효모발현시스템을 구축하였으며 재조합 효모를 이용한 HPV 발현확인 및 western blotting을 이용한 HPV 분석방법을 확립하였음.
▶ Hepatitis B surface antigen(HBsAg)의 유전자 확보 및 다양한 효모발현시스템을 구축하였고 발효조건에 따른 재조합 유전체의 변화를 유전자칩을 이용하여 분석하였며 lab-scale의 고속세포파쇄 기법과 안정적 ELISA 분석기법의 개발 및 배지최적화에 따른 재조합 효모의 세포성장 및 HBsAg의 발현 영향을 분석하였음.
▶ HBsAg 발현 및 분비를 위한 최적의 분비신호를 결정하였고 유전자칩 결과를 바탕으로 단백질접힘(folding)에 관여하는 단백질의 과발현을 통해 최적의 재조합 효모시스템을 구축하였음.
▶ 최적의 HBsAg 발현시스템을 이용한 유가식 배양으로 연구초기 대비 30배 이상 증가된 74.4mg/L의 HBsAg 최종농도를 얻었음.

Abstract ▼

Virus-Like Particle (VLP) is an envelope protein of live virus which can be used as a vaccine candidate. Since the VLPs are produced by genetically engineered cells that do not contain the nonstructural viral genes, it is not infectious and regarded as safe. Recently, may kinds of VLP type vaccine c

Virus-Like Particle (VLP) is an envelope protein of live virus which can be used as a vaccine candidate. Since the VLPs are produced by genetically engineered cells that do not contain the nonstructural viral genes, it is not infectious and regarded as safe. Recently, may kinds of VLP type vaccine candidates against various infectious viruses, such as HBV, HPV, HCV, and rotavirus, are now developing and under clinical stages. The use of insect cell culture system is common for the production of VLP, although it suffers from a high production cost and low yield. As an another choice, Saccharomyces cerevisiae is most promising candidate for VLP production because it is known as GRAS, not costly to culture, and proved to be a good host for HPV VLP production. The objective of this research is focused on the development of efficient production systems using S. cerevisiae for overproduction of Virus-Like Particle, HPV and HBV. For HPV overexpression, two genes of HPV 16L1 and 18L1 were cloned and expressed in recombinant S. cerevisiae. To determine the optimal system for HPV expression, episomal or chromosomal expression cassette containing the GAL1 promoter, mating factor alpha signal sequence and HPV open reading frame were constructed. By batch fermentation and immunoblot analysis, HPV was successfully produced in recombinant S. cerevisiae and its production process was optimized by modulation of culture conditions. For HBV (HBsAg) overproduction, various signal sequences originated from S. cerevisiae mating factor alpha, SUC2 and Kluyveromyces lactis killer toxin were fused with HBsAg and three protease-deficient S. cerevisiae host were transformed with the HBsAg expression systems. Among several systems, S. cerevisiae 2805 transformed with plasmid M CL-HBs δ was chosen as the optimal HBsAg expression system. Genome-wide analysis of the HBsAg expression system proposed five gene candidates for elevation of HBsAg expression level. Among them, TRX2, SEC23, PDI1 gave the positive effects on HBsAg expression ability. Coexpression of HBsAg and PDI1 under the GAL1 promoter and glucose-limited fed-batch fermentation strategy led to a considerable increment of HBsAg expression. Finally, optimized fed-batch fermentation resulted in 74.4 mg/L HBsAg concentration, which was 34 times higher than the initial HBsAg expression level.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...3
• 보고서초록...5
• 요약문...7
• SUMMARY...11
• CONTENTS...13
• 목차...14
• 제1장 연구개발과제의 개요...15
• 제1절 연구개발의 필요성...15
• 1. 연구개발의 과학기술, 사회경제적 중요성...15
• 가. 기술적 측면...15
• 나. 경제.산업적 측면...16
• 다. 사회.문화적 측면...17
• 제2절 연구개발의 목표 및 내용...17
• 1. 연구개발의 최종목표...17
• 2. 연차별 연구개발 목표 및 범위...18
• 제2장 국내외 기술개발 현황...19
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...20
• 제1절 VLP 발현시스템 구축 및 기초 분석방법 구축...20
• 1. VLP 생산을 위한 재조합 S, cerevisiae 균주 제작...20
• 2. 재조합 S. cerevisiae 균주에서 VLP 발현양상의 고찰...25
• 3. 재조합 S. cerevisiae 균주에서 유래된 VLP의 특성 분석...32
• 제2절 VLP 생산성 향상을 위한 유전체 탐색 및 고숙분석법 개발...34
• 1. 고효율 VLP 발현 재조합 S. cerevisiae 시스템 구축...34
• 2. VLP 발현관련 효모유전체 분석...43
• 3. VLP 대량생산공정을 위한 재조합 균주 특성 연구...52
• 제3절 효모유전체의 재설계 및 배양공정 최적화...58
• 1. Chaperone 동시발현을 통한 유전체 재설계 균주의 개발...58
• 2. 재조합 효모발효공정의 대사공학적 모델링 및 해석...78
• 3. 최적 유가식 발효전략의 수립 및 scale-up...101
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...111
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...115
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...116
• 제7장 참고문헌...118